PRÁTICA

PRÁTICAS REALIZADAS

1. PROCESSAMENTO DE AMOSTRA - SEPARAÇÃO DE PLASMA - 17 Jan
2. LAVAGEM DE HEMÁCIAS - Dia 17 Jan
3. TIPAGEM SANGUÍNEA - Dia 24 Jan
4. FATORES INTERFERENTE NA REAÇÃO ANTIGENO ANTICORPO - 31/Jan
5. REAÇÃO DE HEMAGLUTINAÇÃO INDIRETA - HAI-TOXO - Dia 7 Fev
6. REAÇÃO DE FLOCULAÇÃO - VDRL - Dia 14 Fev
7. TESTE DE GRAVIDEZ EM FITA - Dia 14/ fev
8. AGLUTINAÇÃO EM PARTICULAS - Sorotipagem de Salmonella - Dia 14/fev
9.  PURIFICAÇÃO DE ANTICORPOS
10. IMUNOPRECIPITAÇÃO EM GEL (SEG. OUCHTERLONY) Click aqui

PRÁTICA 11: REAÇÃO DE HIPERSENSIBILIDADE RETARDADA E IMEDIATA

1. Objetivos: Realizar o teste intradérmico (Reação de Mantoux) para demonstrar uma reação de hipersensibilidade tardia

2. Princípio: Hipersensibilidade dos indivíduos que tem o organismo impregnado pelo Bacilo de Kock à ação de uma “unidade tuberculínica”, revelando deste modo, a existência de um foco tuberculoso em evolução, simplesmente latente ou mesmo extinto.

            Segundo o Dr. Hugo Pires, do Instituto Vital Brasil, uma “unidade tuberculinica” é a dose de tuberculina calculada em miligrama de proteínas bacteriana do bacilo de Kock, capaz de induzir uma alergia no homem ou no animal infectado com este bacilo.

3. Material: Seringa tipo insulina c/ agulha; antígeno (tuberculina ou PPD ) éter, algodão, régua graduada, isopor com gelo

4. Metodologia:

ÄCom seringa de insulina (1cm³) montada com agulha apropriada injetar 0,1 cm³ da tuberculina na fase anterior do antebraço, formando-se pápula de contorno bem definido;

Ä Fazer a leitura das reações ao fim de 48-72horas medindo, em milímetro, com régua transparente, o diâmetro transversal máximo (em relação com o maior eixo do antebraço). O edema e o eritema não são medidos.

5. Interpretação: Classificar as reações, nos testes intradérmicos, de acôrdo com os seguinte critério:

±   Infiltração com diâmetro inferiores 5mm;

1+ Infiltração com diâmetro entre 5 a 10mm

2+ Infiltração com diâmetro entre 10 a 20mm

3+ Infiltração com diâmetro acima de 20 mm

4+ Infiltração com diâmetro acima de 20mm com área de necrose

OBSERVAÇÕES:

1.      Na leitura das reações com tuberculina (reações de tipo retardado) não levar em conta os diâmetros do eritema, mas somente da enduração (infiltração);

2.      As reações positivas, fortes, em geral perduram 3 ou mais dias;

3.      Nos indivíduos repetidamente injetados com tuberculina (dessensibilização) é comum surgir uma reação local do tipo Arthus, que tem seu acme ao fim de 24 horas, desaparecendo ao fim de 48 horas

QUESTÕES

1. As condições necessárias para realização da prática foram observadas? Qual a influência desssas condições para o Imunodiagnóstico?
2. Os procedimentos realizados estão de acordo com o protocolo. Comente as alterações ou adaptações realizadas
3. Relacione os materiais listados neste protocolo que não foram utilizados e quais outros materiais utilizados. Será que houve alguma falha no procedimento pela falta ou substituição do material?
4. Quais as dificuldades encontradas na realização dessa prática?
5. Os procedimentos de biossegurança foram seguidos com rigor? Quais os possíveis riscos de acidente de trabalho que os alunos e o professor sofreram? Comente sobre as normas de biossegurança.
6. Quais as orientações ao paciente que se deve dar antes e após a coleta de sangue?
7. Elabore 10 questões a respeito da prática ao seu professor, para melhor esclarecimento das suas dúvidas

PRÁTICA 10: IMUNOPRECIPITAÇÃO EM GEL (SEG. OUCHTERLONY)

1. Objetivos: Averiguar uma reação de precipitação; fazer a comparação direta de vários antígenos e antissoros e  estudar as reações cruzadas entre antígenos

2. Princípio:  Tanto o antissoro quanto o antígeno solúvel se difundem no ágar e na zona de equilibrio das concentrações (Ag x Ac) forma um  precipitado que é visto em forma de uma linha.. A precipitação em gel de ágar é amplamente utilizada em imunologia de diagnóstico. Ela é particularmente  útil na quantificação de concentrações de imunoglobulinas e na imunoeletroforese. Na imunoquantificação, o ágar é impregnado por antissoro e o material a ser testado é colocado em orifícios. Os diâmetros dos anéis concêntricos de precipitação que se formam são diretamente proporcionais à concentração do antígeno em questão. Estas técnicas são úteis na quantificação de imunoglobulinas em muitos estudos epidemiológicos, como as doenças imunoproliferativas e as deficiências imunológicas.

4. Material: Lâmina de microscópio, agarose a 1%  preparado salina (contendo mertiolato a 0,01% ou ázida sódica a 0,1%), Citrato de sódio a 5%, Corante Coomasie Blue Brilhante R a 0,15g%, Solução descorante (20ml de ácido acético glacial+40ml Etanol+40ml de água),  molde para perfurar os orifícios; pipeta Pasteur; antissoro; antígeno;

5. Metodologia:

·         Recobrir uma lâmina de microscópio com agarose 0,1%(em água) e deixar secar na estufa;

·         Depositar nessa lâmina cerca de 5ml de agarose a 1%  preparado em salina (contendo mertiolato a 0,01% ou ázida sódica a 0,1%) até obter camada de 3mm de espessura;

·         Esperar solidificar e praticar, com um molde, 1 orifício (3mm de diâmetro) na região central e 3 ou mais em torno do orifício central, de modo que a distância entre os orifícios da circunferência e o central seja aproximadamente 10mm;

·         Colocar o antissoro (10mL) no orifício central e os antígenos em diferentes diluições, nos orificios periféricos. Pode-se, também, proceder de modo inverso;

·         Conservar as lâminas em câmara úmida, no refrigerador, ou a uma outra temperatura constante e observar a formação das linhas de precipitação durante 24 a 48 horas ou mais;

·         Lavar  1hora  com citrato de sódio a 5% e deixar em salina durante 24 horas, fazendo-se 3 a 4 trocas;

·         Envolver em papel de filtro umedecido em água e secar a 37ºC  “overnight”

·         Lavar com água para retirar fragmentos do papel de filtro sobre o gel

·         Corar com Coomasie Blue Brilhante R durante 5min. Descorar com solução descorante, para se obter visualização das linhas de precipitação

6. Interpretação: Averiguar a formação de linhas de precipitação. De acôrdo com o parentesco imunológico dos antígenos empregados, quatro tipo básicos de precipitação podem formar-se nas placas de Ouchterlony: (a) Tipo I – reação de identidade; b) Tipo II – reação de não identidade; c) Tipo III – reação de identidade parcial; d) Tipo IV – reação de inibição.

QUESTÕES

1. As condições necessárias para realização da prática foram observadas? Qual a influência desssas condições para o Imunodiagnóstico?
2. Os procedimentos realizados estão de acordo com o protocolo. Comente as alterações ou adaptações realizadas
3. Relacione os materiais listados neste protocolo que não foram utilizados e quais outros materiais utilizados. Será que houve alguma falha no procedimento pela falta ou substituição do material?
4. Quais as dificuldades encontradas na realização dessa prática?
5. Os procedimentos de biossegurança foram seguidos com rigor? Quais os possíveis riscos de acidente de trabalho que os alunos e o professor sofreram? Comente sobre as normas de biossegurança.
6. Quais as orientações ao paciente que se deve dar antes e após a coleta de sangue?
7. Elabore 10 questões a respeito da prática ao seu professor, para melhor esclarecimento das suas dúvidas

PRÁTICA 9: PURIFICAÇÃO DE ANTICORPO POR COLUNA CROMATOGRÁFICA DE HEMADSOÇÃO DE  ANTICORPOS

OBJETIVO: Demonstrar método de purificação de  anticorpos por cromatografia de hemadsorção

MATERIAL:  10ml de sangue do tipo A+; 10 ml de sangue do sangue do tipo B+;  Agarose (ou  Agar-ágar); Reagentes para tipagem sanguínea; Soro fisiológico; Tubos de ensaio de hemólise; 2 buretas de 25ml  com suporte; Erlenmayer de 50ml; Pipetas de 10ml; Microplacas de titulação; centrifuga;

PROCEDIMENTOS

1. Realizar a tipagem sanguínea das amostras de sangue para confirmar o tipo sanguíneo;
2. Da amostra de sangue do tipo A+, retirar 500uL e adicionar a 9,5ml de solução de agarose a 1%, estéril, fundida e resfriada a 45ºC, homogeneizar e colocar em uma bureta de 25ml. Após o resfriamento completar o volume de 25ml com soro fisiológico. Repetir a operação com amostra de sangue do tipo B+;
3. Separar o plasma ou soros das duas amostras sanguíneas e adicionar soro fisiológico em cada soro para obter uma solução de 30%.
4. Realizar a prova cruzada da tipagem, fazendo reagir o soro diluído de um (A+ ou B+) com as hemácias (B+ ou A+) de outro e vice-versa;
5. Deixar escorrer 15ml do soro fisiológico das buretas e colocar 10ml do soro diluído A+ na bureta de hemácia B+; e 10ml do soro diluído B+ na bureta A+, deixar escorrer, coletando as frações de amostras 1ml, até completa evasão.
6. Em todas as frações do soro A+, adicionar 100uL de suspensão de hemácia B+ e averiguar a reação de aglutinação. Fazer o mesmo com o soro B+, adicionando 100uL da hemácia A+;
7. Caso não se observe aglutinação em nenhum do tubos ( exceto o controle ), adicione  mais 15ml de solução de NaCl a 2,7% nas buretas para desgrudar os anticorpos das hemácias e repetir a etapa anterior.

 RESULTADOS

Anotar os resultados na tabela abaixo, colocando  o sinal ( + ) quando observado aglutinação e  ( - ) na ausência de aglutinação.

	Eluído com soro fisiológico		Eluído com sol. NaCl 2,7%
Tubos (Frações)	Soro do Sangue A+	Soro do Sangue B+	Soro do Sangue A+	Soro do Sangue B+
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Controle soro A+
Controle soro B+

Nos tubos com as frações e controle A+, são adicionadas hemácias B+; Nos tubos com as frações e controle B+, são adicionadas hemácias A+;

( + ) Reação de hemaglutinação; ( -  ) Ausência de hemaglutinação

Discuta  os resultados, respondendo as seguintes questões:

QUESTÕES

1. As condições necessárias para realização da prática foram observadas? Qual a influência dessas condições para os objetivos da experiência?
2. Os procedimentos realizados estão de acordo com o protocolo. Comente as alterações ou adaptações realizadas
3. Relacione os materiais listados neste protocolo que não foram utilizados e quais outros materiais utilizados. Será que houve alguma falha no procedimento pela falta ou substituição do material?
4. Quais as dificuldades encontradas na realização dessa prática?
5. Os procedimentos de biossegurança foram seguidos com rigor? Quais os possíveis riscos de acidente de trabalho que os alunos e o professor sofreram? Comente sobre as normas de biossegurança.
6. Caso sejam observados aglutinações em todas as frações do soro, que conclusão se pode tirar?
7. Caso sejam observados ausência de  aglutinações em todas as frações do soro, que conclusão se pode tirar?
8. Caso sejam observados aglutinações somente nas frações do soro eluído como soro fisiológico, que conclusão se pode tirar?
9. Caso sejam observados aglutinações somente nas frações do soro eluído como sol. NaCl a 2,7%, que conclusão se pode tirar?
10. Elabore 10 questões a respeito da prática ao seu professor, para melhor esclarecimento das suas dúvidas

PRÁTICA 8: SOROTIPAGEM DE BACTÉRIAS - SOROKIT PARA SALMONELLA 

Os soros somáticos e flagelares para identificar os sorogrupos mais freqüentes e os sorotipos de maior
significado clínico e estão na diluição apropriada para serem utilizados em testes de aglutinação em
lâmina. O Sorokit é composto pelos antisoros abaixo:

Soros somáticos (O): permitem identificar os sorosgrupos A, B, C1, C2, D, E e o antígeno Vi.
Soros flagelares (H): permitem identificar os antígenos flagelares a; b; c; d; i; 1, 2 e 5.

Composição:
Soro de coelho hiperimunizado........................................... 0,3 ml
Solução salina ................................................................... 2,7 ml
Conservante ..................................................................... 0,015 ml


Princípios da Identificação:

Os soros somáticos visam identificar os grupos sorológicos A, B, C1, C2, D, E que representam, aproximadamente, 98% das salmonellas isoladas do homem e o antígeno Vi, que ocorre em S. Typhi e

S. Paratyphi C.

Os soros H permitem caracterizar os antígenos flagelares de Salmonella, o que torna possível identificar um único sorotipo, dentro de um sorogrupo. Os antígenos H podem ocorrer em 2 fases antigenicamente distintas. Os diferentes sorotipos de Salmonella spp podem apresentar apenas 1 fase (sorotipos monofásicos) ou as 2 fases (sorotipos bifásicos). Embora bifásicos, as amostras recém isoladas apresentam, freqüentemente, apenas uma das fases. Neste caso, para a identificação definitiva do sorotipo há necessidade de provocar o aparecimento da outra fase (reversão de fase), o que se consegue cultivando a Salmonella spp em um meio de cultura que contém soro os flagelos da fase que está ocorrendo.

A tabela abaixo mostra as fórmulas antigênicas dos sorotipos de Salmonella spp que o Sorokit Probac permite dentificar e que são sorotipos de maior importância médica. Estes sorotipos são S. Typhi, S. Paratyphi A, S. Paratyphi C, agentes das febres tifóides e paratifóides, S. Cholerae-suis, que freqüentemente causa septicemia, e S. Typhimurium que é o sorotipo mais importante de infecção intestinal.

Procedimento:

Deve ser utilizada a técnica de aglutinação em lâmina.

1. Identificação do sorogrupo:
Após a identificação do gênero Salmonella através de testes bioquímicos e aglutinação nos soros
polivalentes PROBAC, aglutinar a amostra com soros A, B, C1, C2, D e E. A Salmonella pertencerá ao
grupo em que houver aglutinação. Se a reação for negativa, aquecer metade da suspensão a 100°C
(banho maria fervente) durante 10 minutos e repetir o teste. A suspensão não aquecida deverá ser
utilizada para determinação dos antígenos flagelares.

2. Identificação do sorotipo:

• Amostras do grupo A: deverão ser testadas com soro flagelar a. Se a reação for positiva, a amostra corresponderá a Salmonella Paratyphi A; neste grupo não ocorrem outras Salmonellas spp com antígeno flagelar a.
• Amostras do grupo B: deverão ser testadas com os soros flagelares b; i; 1,2,5. Se a aglutinação ocorrer nos soros b e 1,2,5 a amostra será Salmonella Paratyphi B. Se a aglutinação ocorrer no soro b e não no 1,2,5 a amostra será provavelmente o mesmo sorotipo, uma vez que no grupo B, outros sorotipos com antígeno flagelar b são muito raros. Se a aglutinação ocorrer nos soros i e 1,2,5 a amostra será Salmonella Typhimurium. Se a aglutinação acontece só com o soro i, e não com 1,2,5 também provavelmente será S.Typhimurium, uma vez que este sorotipo representa a grande maioria das Salmonelas com antígeno flagelar i.
• Amostras do grupo C1: deverão ser testadas no soro c e 1,2,5. Se a aglutinação ocorre nos dois soros, a amostra poderá ser a Salmonella Paratyphi C ou a Salmonella Cholerae-suis, dependendo de suas características bioquímicas. A Salmonella Paratyphi C usualmente fermenta a arabinose e sempre fermenta a trealose, enquanto que a S. Cholerae-suis não fermenta estes açúcares. Por outro lado, a S. Paratyphi C fermenta dulcitol em 48 horas, enquanto a S. Cholerae-suis não fermenta ou fermenta tardiamente este carboidrato. Deve ser também lembrado que na maioria das amostras de S. Cholerae-suis os flagelos de fase 1 (tabela 1) estão reprimidos; portanto as amostras do grupo C1 que aglutinam no soro 1,2,5 e não fermentam a arabinose, trealose e dulcitol, devem ser consideradas S. Cholerae-suis.
• Amostras do grupo D: deverão ser testadas com soro flagelar d. Se a amostra aglutina neste soro, não produz gás, produz pouco ou nenhum H2S e é citrato de Simmons negativo, a amostra será Salmonella Typhi. Esta amostra deverá ser testada também com soro Vi, o resultado podendo ser positivo (amostras ricas em Vi) ou negativo (amostras pobres em Vi). É interessante lembrar que amostras muito ricas em antígeno Vi podem deixar de aglutinar no soro do grupo D. Entretanto, após destruição do Vi por calor (100°C por 10min.) a amostra passa a aglutinar neste soro. Algumas amostras de S. Typhi quando recém isoladas, são pouco móveis e podem deixar de aglutinar no soro flagelar d. Porém, se apresentarem características bioquímicas e aglutinarem nos soros D e/ou Vi, podem ser identificadas como S. Typhi.
• Amostras dos sorogrupos C2 e E: correspondem a diferentes sorotipos que causam infecções intestinais. A identificação destes sorotipos fica restrita a laboratórios de referência, uma vez que exige um grande número de soros flagelares. O mesmo é válido para amostras dos sorogrupos A, B, C1 e D que não aglutinaram com os soros flagelares do Sorokit Probac.

Precauções:
Após leitura, a lâmina com a suspensão antígeno-antisoro, deve ser descartada conforme as
recomendações vigentes para resíduos de serviços de saúde.

Apresentação: Frasco com 3 ml               Conservação: Manter em geladeira (2º- 8ºC).
Validade: 36 meses

 Referências Bibliográficas: 
1. Edwards,P.R. & Ewing,W.H. - Identification of Enterobacteriaceae. Burgess Publishing Company,
Minneapolis, Minnesota, 1972.
2. Murray, P.R. et al. – Manual of Clinical Microbiology, 8th ed.,ASM Press, Washinghton, DC, 2003.
3. Koneman, E. W.; Allen, S. D. et al : Color Atlas and Textbook of Diagnostic Microbiology, 6th Edition.
J. B. Linpcott Company, Philadelphia, 2006.

QUESTÕES

1. As condições necessárias para realização da prática foram observadas? Qual a influência dessas condições para os objetivos da experiência?
2. Os procedimentos realizados estão de acordo com o protocolo. Comente as alterações ou adaptações realizadas
3. Relacione os materiais listados neste protocolo que não foram utilizados e quais outros materiais utilizados. Será que houve alguma falha no procedimento pela falta ou substituição do material?
4. Quais as dificuldades encontradas na realização dessa prática?
5. Os procedimentos de biossegurança foram seguidos com rigor? Quais os possíveis riscos de acidente de trabalho que os alunos e o professor sofreram? Comente sobre as normas de biossegurança.
6. Não havendo um fornecedor dos antissoros, como proceder para se conseguí-los no laboratório, a partir de amostras padrões de Salmonella sorotipadas?
7. Uma suspensão de bactéria identificadas bioquimicamente como Salmonella foi submetida a sorotipagem, sendo observado aglutinação com os soros  somáticos O. Que conclusão pode-se tirar?
8. Os soros H permitem caracterizar os antígenos flagelares de Salmonella, o que torna possível identificar um único sorotipo, dentro de um sorogrupo. Os antígenos H podem ocorrer em 2 fases antigenicamente distintas? Justifique.
9. Embora bifásicos as amostras de Salmonella recém isoladas apresentam frequentemenete apenas uma das fases. Para identificação definitiva do sorotipo há necessidade de provocar a reversão de fase antigênica (aparecimento de outra fase). Como proceder para realizar o teste de forma segura?
10. Elabore 10 questões a respeito da prática ao seu professor, para melhor esclarecimento das suas dúvidas

PRÁTICA 7: TESTE DE GRAVIDEZ  - 
FORMATO HCG 1049 EZ-HCG BIOMERICA

FINALIDADE:
O Teste de Gravidez EZ-HCG BIOMERICA, detecta a gravidez através da presença do hormônio hCG (Gonadotrofina Coriônica Humana) na urina. Somente para uso diagnóstico IN VITRO.

FUNDAMENTO:

O Teste de Gravidez EZ-HCG BIOMERICA é o resultado de um avançado processo biotecnológico, onde utiliza anticorpos monoclonais, policlonais e reagentes coloidais detectando a presença do hormônio hCG, mesmo em quantidade mínima, no primeiro dia de atraso menstrual.

MATERIAIS INCLUSOS NO KIT:

O Teste de GravidezEZ-HCG BIOMERICA vem em embalagem individual descartável junto com um sachê absorvente de umidade para maior proteção. Apresentado em forma de fita o Teste de Gravidez EZ-HCG BIOMERICA divide-se em três partes: Ponta absorvente, contendo anticorpos monoclonais (anti hCG), Zona de controle e Zona de resultado.

 
ADVERTÊNCIAS E PRECAUÇÕES:

• Destinado somente para uso ”IN VITRO”, uso externo.
  Usar recipiente adequado ao teste, seguindo normas de higiene,
• para evitar a transmissão de agentes infecciosos.
  Para melhor resultado, abra a embalagem somente no momento de efetuar o teste .
• Manter o Teste de Gravidez BIOMERICA em temperatura ambiente, contra calor e umidade.
• Não reutilizar o teste após seu uso. Descarte-o em recipiente adequado.
• Manter fora do alcance das crianças.

ESTABILIDADE E ARMAZENAGEM:

O Teste de Gravidez EZ-HCG BIOMERICA é estável até a data de validade impressa na embalagem. Manter em temperatura ambiente (l5° - 28°C).

COLETA DE URINA:

A amostra deve ser recolhida num recipiente limpo e seco, de plástico ou vidro, sem qualquer aditivo. A primeira urina do dia é a melhor por conter maior concentração de hCG, mas o teste poderá ser realizado com urina colhida, a qualquer hora do dia. As amostras podem ser refrigeradas (2-8º C) e guardadas até 72 horas antes do teste. Amostras refrigeradas devem ficar em temperatura ambiente antes de aplicar o teste (fig.1).

INSTRUÇÕES DE USO:

PARA MELHOR RESULTADO LER CUIDADOSAMENTE AS INSTRUÇÕES DE USO ANTES DE REALIZAR O TESTE.

1.    Verifique a data de validade impressa no sachê de alumínio.
2.    Siga corretamente as instruções antes de fazer o teste.
3.    Colete a urina conforme as instruções.
4.    Abra o sachê de alumínio ao longo do picote e retire o
       dispositivo de Teste EZ-HCG BIOMERICA, coloque-o numa
       superfície limpa e plana, com a tarja de leitura voltada para
       cima até que se visualize o resultado.
5.    Encha o gotejador com urina e mantenha-o, na posição
       vertical (Fig.3). Aperte levemente o gotejador e aplique três
       (3) gotas de urina, no quadradinho marcado com ("S") do
       dispositivo.
6.    Os resultados deverão ser lidos após 5 minutos.

IMPORTANTE: Dentro do sachê, existe um saquinho com sílica que não deve ser utilizado no teste, (serve apenas para absorver a umidade).

LEITURA DO RESULTADO DE SEU TESTE:

1 - POSITIVO - “GRÁVIDA”

Surgindo 2 (duas) linhas em tons vermelho na área de resultado a confirmação é positiva e você está grávida(Fig.2).

2 - NEGATIVO  - "NÃO GRÁVIDA"
Surgindo l (uma) linha em tom vermelho na área de resultado, a confirmação será negativa e você não está grávida. (Fig.3).

3 - RESULTADO INVÁLIDO
Se após cinco minutos de iniciado o teste não aparecer nenhuma linha na área de resultado, significa que o resultado está inválido. Provavelmente as instruções não foram seguidas corretamente. Repita o teste no dia seguinte, usando outro Teste de Gravidez EZ-HCG BIOMERICA. (Fig. 4).

LIMITAÇÕES DO PROCEDIMENTO:

Como com todo teste de gravidez, o diagnóstico final não deve ser feito baseado no resultado de um único teste, mas deve se basear em uma correlação dos resultados do teste com sinais clínicos típicos e sintomas.

VALORES ESPERADOS:

Mulheres não grávidas não possuem níveis de HCG detectáveis pelo teste EZ-HCG BIOMERICA. Níveis de aproximadamente 15 mIU/ml, podem ser detectados nos primeiros dois ou três dias de ausência do ciclo menstrual. O pico de hCG de >37.000 mIU/ml ocorre, cerca de 8-10 semanas após o último período menstrual e então declina para valores mais baixos durante o resto da gravidez.

QUESTÕES

1. As condições necessárias para realização da prática foram observadas? Qual a influência dessas condições para a realização dos experimentos?
2. Os procedimentos realizados estão de acordo com o protocolo. Comente as alterações ou adaptações realizadas
3. Relacione os materiais listados neste protocolo que não foram utilizados e quais outros materiais utilizados. Será que houve alguma falha no procedimento pela falta ou substituição do material?
4. Quais as dificuldades encontradas na realização dessa prática?
5. Os procedimentos de biossegurança foram seguidos com rigor? Quais os possíveis riscos de acidente de trabalho que os alunos e o professor sofreram? Comente sobre as normas de biossegurança.
6. Elabore 10 questões a respeito da prática ao seu professor, para melhor esclarecimento das suas dúvidas

PRÁTICA 6: REAÇÃO DE FLOCULAÇÃO - TESTE DE VDRL

 (VENEREAL DISEASE RESEARCH LABORATORIES) -   

FINALIDADE: Método de triagem para detecção de reaginas da sífilis.

Somente para uso diagnóstico in vitro.

PRINCÍPIO DE AÇÃO: Metodologia: Reação de floculação. A combinação de lecitina, colesterol e cardiolipina possui semelhança imunológica com antígenos do Treponema pallidum, consistindo em um antígeno não treponêmico. A interação das reaginas da amostra com este antígeno produz floculação que pode ser detectada ao microscópio óptico.

REAGENTES

Número 1 - Antígeno para VDRL em suspensão - conservar entre 2 e 8 oC. Não congelar. Homogeneizar bem antes de usar. Contém: Cardiolipina 0,44 μmol/L, lecitina 3,12 μmol/L e colesterol 23,2 μmol/L em tampão fosfato 10 mmol/L pH 6,0.

APRESENTAÇÃO

Reagente Volume

Reagente No 1 .........6 mL

EQUIPAMENTOS E INSUMOS OPERACIONAIS

Lâmina escavada, microscópio, agitador rotativo ajustávela 180 rpm, pipetas, relógio ou cronômetro. Encontram-se no mercado especializado de artigos para Laboratórios de Análises Clínicas.

CONDIÇÕES DE ARMAZENAMENTO E TRANSPORTE

A temperatura de armazenamento deverá ser de 2 a 8C. O transporte em temperaturas entre 15 e 30C não deverá exceder 72 (setenta e duas) horas.Não congelar. Manter ao abrigo da luz e evitar umidade.

CUIDADOS ESPECIAIS

1 - Somente para uso diagnóstico in vitro;

2 - O Antígeno (Reagente Nº 1) e a amostra devem estar à temperatura ambiente no momento do uso;

3 - Não congelar o reagente;

4 - Não utilizar plasma;

5 - O descarte do material utilizado deverá ser feito obedecendo-se os critérios de biossegurança de acordo com a legislação vigente.

6 - O reagente não deve entrar em contato com materiais de borracha.

AMOSTRAS

Soro ou líquido cefalorraquidiano (límpido e isento de fragmentos de coágulos). Não utilizar soros hemolisados ou lipêmicos, pois podem produzir aglutinação inespecífica. A amostra é estável por 05 dias entre 2 e 8 C. Não é preciso inativar o soro. É recomendável jejum de 8 horas antes da coleta de sangue.

DESCRIÇÃO DO PROCESSO

O Reagente Nº 1 é pronto para o uso. Agitá-lo antes da execução do teste.

TÉCNICA

Em uma placa escavada pipetar:

___________________________________________________________________________

Amostra ...................50 μL

Reagente Nº 1 ..........20 μL

Agitar manualmente com movimentos circulares ou em um agitador por 4 minutos a 180 rpm. Em seguida, examinar no microscópio no aumento 100 X. Além do teste sem diluição é recomendado uma teste com uma diluição de 1:8 com NaCl 0,85% (para todos os testes), a fim de evitar o efeito prozona. Vide Limitações do Processo.

PROVA SEMI QUANTITATIVA

Cavidade Nº 1 2 3 4 5 6

Diluição 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64

Pipetar em cada cavidade da lâmina escavada 50 L de NaCl 0,85%. Na cavidade Nº 1, pipetar 50 L da amostra a ser titulada, homogeneizar. Transferir 50 L da cavidade Nº 1 para a Nº 2 e assim sucessivamente até a diluição desejada. Desprezar os 50 L em excesso da última escavação.

Em seguida adicionar à cada cavidade, 20 L do Reagente Nº 1. Agitar manualmente com movimentos circulares ou em um agitador rotativo por 5  minutos a 180 rpm. Examinar ao microscópio no aumento 100 X, logo após a agitação. O título corresponde à maior diluição da amostra em que ocorreu a floculação.

TESTE COM LÍQUIDO CEFALORRAQUIDIANO

1 - Diluir 1:2 o Reagente Nº 1 com NaCl 0,85%; deixar em repouso por 4 minutos.

2 - Proceder da mesma forma descrita para o soro, usando o líquido cefalorraquidiano centrifugado. Não é necessário inativar.

RESULTADOS

Positivo - Reativo: ocorre floculação com formação de grumos de tamanhos variáveis. Suspensão de aspecto heterogêneo. Neste caso, proceder a diluição da amostra e realizar a prova semi-quantitativa. Negativo - Não Reativo: ausência de floculação, suspensão de aspecto homogêneo.

LIMITAÇÕES DO PROCESSO

Estima-se que 1 a 2% dos pacientes com sífilis secundária apresentam VDRL negativo ou fracamente positivo quando se utiliza o soro não diluído. A positivação do exame somente ocorrerá nas diluições maiores - efeito prozona. Recomenda-se portanto, testar todas as amostras sem diluir e diluídas 1:8 com NaCl 0,85%. Pode ocorrer resultado falso-positivo em certas patologias como : tuberculose, mononucleose infecciosa, hanseníase,hepatite, doenças do colágeno (lúpus eritematoso, artrite reumatóide), doenças auto imunes, malária, câncer.

DESEMPENHO DO PRODUTO

Sensibilidade: Em 163 amostras verdadeiramente positivas, não foi encontrado nenhum resultado falso negativo. Especificidade: Em 80 amostras verdadeiramente negativas foi encontrado 1 resultado falso positivo.

ESPECIFICIDADE DIAGNÓSTICA

O método é indicado para teste de triagem. O diagnóstico final não deve ser baseado somente no resultado laboratorial, deve-se correlacionar o resultado com os sinais e sintomas clínicos do paciente. Pacientes com infecção sifílica tratada podem apresentar resultados positivos em títulos baixos (cicatriz sorológica). O VDRL pode ser utilizado para acompanhar a terapêutica, pela rápida resposta representada pela queda de títulos ou mesmo pela negativação e modificações mais lentas ou mesmo inexistentes para os testes  treponêmicos.

CONTROLE INTERNO DE QUALIDADE

Deve ser prática rotineira do Laboratório Clínico o uso de controles positivo e negativo para assegurar um desempenho adequado do método.

NÚMERO DE TESTES  300 Testes

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1 - GRADWOHLS Clinical Laboratory Methods and Diagnosis

– Sonnen Writh and Jerret, Mosby Cd., 1980.

2 - Manual de Reaciones Para el Diagnóstico de la Sífilis -

nº 311 – Organização Mundial de Saúde.

3 - Ferreira, A.W.; Diagnóstico Laboratorial das Principais

Doenças Infecciosas e auto-imunes, 2 ed., Editora

Guanabara Koogan SA, 2001.

QUESTÕES

1. As condições necessárias para realização da prática foram observadas? Qual a influência dessas condições para a realização dos experimentos?
2. Os procedimentos realizados estão de acordo com o protocolo. Comente as alterações ou adaptações realizadas
3. Relacione os materiais listados neste protocolo que não foram utilizados e quais outros materiais utilizados. Será que houve alguma falha no procedimento pela falta ou substituição do material?
4. Quais as dificuldades encontradas na realização dessa prática?
5. Os procedimentos de biossegurança foram seguidos com rigor? Quais os possíveis riscos de acidente de trabalho que os alunos e o professor sofreram? Comente sobre as normas de biossegurança.
6. Elabore 10 questões a respeito da prática ao seu professor, para melhor esclarecimento das suas dúvidas

PRÁTICA 5: REAÇÃO DE HEMAGLUTINAÇÃO INDIRETA PARA TOXOPLASMOSE

FUNDAMENTO

Eritrócitos estabilizados de aves e sensibilizados com componentes antigênicos do Toxoplasma gondii altamente purificados são aglutinados pelos anticorpos anti-Toxoplasma gondii presentes na amostra analisada.

APLICAÇÃO CLÍNICA

A toxoplasmose é uma zoonose de distribuição mundial, doença infecciosa congênita ou adquirida, causada pelo protozoário Toxoplasma gondii. Como ele parasita todas as células nucleares, as manifestações clinicas podem ser muito variáveis, tais como: coriorretinites, miocardites, pericardites, pneumonias, miosites, meningoencefalites e hepatites.

O problema mais sério que resulta da infecção por Toxoplasma gondii é a transmissão congênita do parasita ao feto durante a gravidez.

O comprometimento fetal severo pode acarretar a morte do feto, a morte do recém nascido ou a enfermidade congênita, expressada por uma tríade de sintomas: hidrocefalia ou microcefalia, coriorretinite e calcificação cerebral.

A transmissão congênita transplacentária da toxoplasmose depende basicamente da existência de infecções agudas na etapa gestacional.

Quanto menor a idade gestacional, maior o risco de comprometimento fetal, sendo que o comprometimento mais grave ocorre no primeiro trimestre da gestação.

O diagnóstico da toxoplasmose jamais poderá ser estabelecido com base em dados puramente clínicos. Há sempre necessidade da confirmação laboratorial e correta interpretação dos resultados.

A interpretação dos resultados da imunofluorescência indireta na caracterização de ausência de infecção atual ou pregressa deve ser baseada na presença ou ausência de anticorpos IgG e IgM anti-toxoplasma.

Os principais métodos laboratoriais para o diagnóstico da toxoplasmose são a imunofluorescência indireta (IFI), a hemaglutinação passiva (HAI) e os ensaios imunoenzimáticos (ELISA).

AMOSTRA

Preparo do Paciente

Colher sangue pela manhã após jejum de 8 horas, salvo orientações médicas.

Amostras utilizadas

Soro.

Usar soros frescos ou conservados a -20 ºC de pacientes em jejum.

Não usar soro hemolisado, contaminado ou lipêmico.

Evitar o congelamento e descongelamento repetido do soro.

Os soros envelhecidos tendem a se gelificar ao contato com o 2-mercaptoetanol.

Volume ideal utilizado para análise

(Definir o volume ideal a ser encaminhado para análise).

Volume mínimo utilizado para análise

(Definir o volume mínimo a ser encaminhado para análise).

Fazer referência ao manual ou POP de coleta, separação e distribuição de material.

REAGENTE UTILIZADO

TOXO-HAI                    CAT. 511                      MS 80022230157

GOLD ANALISA DIAGNÓSTICA LTDA

CNPJ – 03.142.794/0001-16

Av. Nossa Senhora de Fátima, 2363

Belo Horizonte – MG – Brasil

Farmacêutica Responsável: Ludmilla Parreiras Campos CRF-MG 5463

Componentes do kit

Conservar entre 2-8 ºC. Não congelar.

1- Suspensão de Hemácias - Contém suspensão de hemácias de aves sensibilizadas com componentes antigênicos do Toxoplasma gondii em solução tampão salina formalizada. Pronta para uso. Armazenar em posição vertical  para evitar auto-aglutinação irreversível.

Deixar em temperatura ambiente antes do uso para estabilização.

Homogeneizar bem, sempre com movimentos circulares e por inversão do frasco. Não agitar, pois isto pode acarretar hemólise e/ou autoaglutinação.

2- Diluente - Contém tampão fosfato salino. Pronto para uso.

3- 2-Mercaptoetanol - Solução concentrada de 2-mercaptoetanol. Conservar ao abrigo da luz.

4- Controle Positivo - Soro humano em tampão salino e azida sódica 15,4 mmol/L.

5- Controle Negativo - Soro humano em tampão salino e azida sódica 15,4 mmol/L.

Material Auxiliar

1-   Placa de microtitulação contendo 96 poços de fundo em “V”. Manter em sua embalagem original entre 2 a 30°C.

Estabilidade

Os reagentes são estáveis até o vencimento da data de validade impressa no rótulo do produto e na caixa quando conservados na temperatura recomendada, bem vedados e se evite a contaminação durante o uso.

Precauções e Cuidados Especiais

1- Aplicar os cuidados habituais de segurança na manipulação dos reagentes e amostra biológica.

2- Recomendamos o uso das Boas Práticas de Laboratórios Clínicos para a execução do teste.

3- De acordo com as instruções de biossegurança, todas as amostras devem ser manuseadas como materiais potencialmente infectantes.

4- Descartar os reagentes e as amostras de acordo com as resoluções normativas locais, estaduais e federais de preservação do meio ambiente.

5- Recomendamos o uso de equipamentos de proteção individual (EPI) como avental, óculos de segurança, luvas descartáveis e outros que se fizerem necessários para a realização do teste.

6- Os controles contém azida sódica como conservante. Não ingerir ou aspirar. Evitar contato com a pele e mucosa.

7- Todos os reagentes derivados do sangue humano foram testados para anticorpos anti-HCV, anti-HIV e antígeno HbsAg e apresentaram resultados negativos. No entanto, devem ser tratados com precaução, como potencialmente infectantes. Manusear e descartar as normas de biossegurança.

PROCEDIMENTO

Procedimento Técnico Manual

Notas

1- Usar exclusivamente a placa do kit e não reutilizar as cavidades.

2- Recomenda-se que todos os resultados positivos sejam confirmados por outro método diagnóstico.

3- São aceitáveis variações de 1 ou 2 títulos para um mesmo soro nas reações de hemaglutinação.

4- Excesso de incubação do soro com 2-mercaptoetanol (mais de 60 minutos) facilita a gelidificação parcial do soro.

5- As amostras devem estar em temperatura ambiente antes do uso e não necessitam de qualquer tratamento prévio.

Teste Qualitativo

Objetivo: Fazer triagem e eliminação dos soros não reagentes.

1- Colocar a placa de microtitulação sobre um pano úmido para neutralizar as forças eletrostáticas.

2- Usar 1 cavidade da placa por amostra, incluindo sempre os controles positivo e negativo.

3- Diluir em tubo de ensaio: 310 µL do Diluente (2) + 10 µL da amostra (diluição 1/32).

4- Pipetar 25 µL do Controle Positivo (P) e 25 µL do Controle Negativo (N) nas cavidades  A1 e  A2.

Atenção: Não diluir os soros controles.

5- Pipetar 25 µL da diluição 1/32 de cada amostra para as respectivas cavidades da placa.

6- Adicionar 25 µL da Suspensão de Hemácias (1) homogeneizada em cada cavidade contendo os soros controles e as amostras de pacientes.

7- Agitar a placa por vibração mecânica (agitador de placas) ou batendo com os dedos nas bordas da placa por 3 a 4 minutos.

8- Deixar a placa sobre o pano úmido em repouso por 1 a 2 horas em temperatura ambiente, em local livre de vibrações. IMPORTANTE.

9- Fazer a leitura.

LEITURA E INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS

Reação Negativa

As hemácias se depositam no fundo da cavidade com um formato semelhante a um botão.

Significa ausência de anticorpos específicos anti-Toxoplasma gondii ou que estes existem abaixo do limite de detecção.

Reação Positiva

As hemácias se depositam no findo da cavidade como um tapete, ás vezes com bordas irregulares.

Significa presença de anticorpos específicos anti-Toxoplasma gondii.

Notas

1-   Soros que dão reação negativa são informados como Não Reagentes, significando ausência de infecção atual ou pregressa para toxoplasmose.

2-   Nos casos em que ocorre reação negativa, mas com suspeitas clinicas de toxoplasmose deve-se repetir o teste após alguns dias, pois pode tratar-se de período pré-sorológico.

3-   Os soros positivos deverão ser testados em paralelo no Teste Semi-Quantitativo e no teste com 2- Mercaptoetanol para determinação da fase da doença.

Teste Semi-Quantitativo

Objetivo: Titular os soros que apresentaram reação positiva no teste qualitativo.

1- Colocar a placa de microtitulação sobre um pano úmido para neutralizar as forças eletrostáticas.

2- Preparar diluição do soro com resultado positivo no teste qualitativo a 1/32 conforme item 3 do Teste Qualitativo.

3- Pipetar 25 µL do Diluente (2) a partir da segunda cavidade da placa até a diluição que se pretende estudar. Exemplo: Se for diluir o soro até 1/512, pipetar 25 µL do diluente nas cavidades A2, A3, A4 e A5. Não pipetar na A1.

4- Pipetar 25 µL da diluição 1/32 da amostra positiva na primeira e segunda cavidades (A1 e A2) da microplaca.

5- Homogeneizar bem o soro com o diluente na segunda cavidade (diluição 1/64) e transferir 25 µL para a terceira cavidade (diluição 1/128) e assim sucessivamente, desprezando no final 25 µL da mistura.

6- Pipetar 25 µL da Suspensão de Hemácias (1) devidamente homogeneizada em todas as cavidades contendo amostras. Após a adição das hemácias teremos diluições de 1/32 (A1) até 1/512 (A5).

7- Agitar suavemente a placa por vibração mecânica ou batendo com os dedos nas bordas da placa durante 3 a 4 minutos.

8- Deixar a placa sobre o pano úmido em repouso por 1 a 2 horas em temperatura ambiente, em local livre de vibrações. IMPORTANTE.

9- Fazer a leitura. Ver Teste Qualitativo.

LEITURA E INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS

Título da Amostra

Maior diluição que apresentar uma reação positiva.

O ponto final é quando o tapete de hemácias cobre 50% do fundo da cavidade

Determinação de Infecção Recente (IgM) ou Presença de Anticorpos Inespecíficos

Nos testes de hemaglutinação, o uso do 2-Mercaptoetanol possibilita a diferenciação de infecção recente ou presença de anticorpos inespecificos.

Teste com 2-Mercaptoetanol

a) Preparo do 2-Mercaptoetanol: Misturar 7 µL de 2-Mercaptoetanol (3) com 1000 µL de Diluente (2).

b) Tratamento do soro: Pipetar em um tubo de ensaio 10 µL de soro inativado ou não e adicionar 310 µL da solução de 2-Mercaptoetanol diluída (corresponde a uma diluição 1/32). Incubar a mistura a 37 °C por 1 hora.

c) Realizar o teste do soro tratado com 2-Mercaptoetanol sempre em paralelo ao teste semi-quantitativo, seguindo o seguinte protocolo:

1- Colocar a placa de microtitulação sobre um pano úmido para neutralizar as forças eletrostáticas.

2- Pipetar 25 µL do Diluente (2) a partir da segunda cavidade da placa até a diluição que se pretende estudar. Exemplo: Se for diluir o soro até 1/512, pipetar 25 µL do diluente nas cavidades A2, A3, A4 e A5. Não pipetar na A1.

3- Pipetar 25 µL do soro tratado com 2-Mercaptoetanol (diluição 1/32) na primeira e segunda cavidades (A1 e A2) da microplaca.

4- Homogeneizar bem o soro tratado com o diluente na segunda cavidade (diluição 1/64) e transferir 25 µL para a terceira cavidade (diluição 1/128) e assim sucessivamente, desprezando no final 25 µL da mistura.

5- Pipetar 25 µL da Suspensão de Hemácias (1) devidamente homogeneizada em todas as cavidades contendo amostras. Após a adição das hemácias teremos diluições de 1/32 (A1) até 1/512 (A5).

6- Agitar suavemente a placa por vibração mecânica ou batendo com os dedos nas bordas da placa durante 3 a 4 minutos.

7- Deixar a placa em repouso sobre o pano úmido por 1 a 2 horas em temperatura ambiente, em local livre de vibrações. IMPORTANTE.

8- Fazer a leitura. Ver Teste Qualitativo.

Interpretação dos Resultados

Título da Amostra

Maior diluição que apresentar uma reação positiva. O ponto final é quando o tapete de hemácias cobre 50% do fundo da cavidade.

Interpretação dos Testes

Soro não tratado e soro tratado com 2-Mercaptoetanol

1- Se os resultados dos dois (2) testes forem negativos indica que o paciente não teve contato com Toxoplasma gondii. Havendo suspeita de infecção recente, deve-se repetir o teste com nova amostra no intervalo de 15 dias.

2- Se nos dois (2) testes forem obtidos resultados com títulos elevados indica a presença de anticorpos da classe IgG.

3- Se for observada uma queda de 2 ou mais títulos do soro tratado em relação ao não tratado significa uma provável infecção recente (presença de IgM).

4- Se o título do soro tratado e do não tratado com 2-Mercaptoetanol forem semelhantes (menos de 2 diluições) significa uma provável toxoplasmose pregressa.

Atenção

Este resultado não exclui infecção recente (presença de anticorpo IgM). Neste caso, deve-se empregar técnicas mais sensíveis (Imunofluorescência ou ELISA) para detectar IgM.

5-Se os títulos forem baixos no soro não tratado e negativo com o soro tratado com 2- Mercaptoetanol, deve-se afastar a presença de anticorpos inespecíficos, devendo repetir o teste com nova amostra após 1 a 2 semanas e observar se ocorre aumento do titulo.

Nota

O Teste de hemaglutinação associado a técnicas mais sensíveis como a imunofluorescência ou ELISA possibilita estabelecer perfis sorológicos que melhor caracterizam as fases da doença.

CONTROLE DA QUALIDADE

Materiais

Identificar os materiais de controle interno e externo da qualidade, citando fabricante e número de catálogo.

Referenciar POP para limpeza e secagem dos materiais utilizados.

Controle Interno

Descrever a calibração periódica de pipetas, equipamentos utilizados, controle de temperatura ambiente e geladeiras para armazenamento dos kits.

Citar a utilização de amostras controles (nível normal –código --------- e patológico –código -------) nas análises realizadas juntamente com a freqüência da utilização dos mesmos. Descrever o procedimento de verificação de novos lotes de controles e reagentes.

Citar POP para controle interno.

Controle Externo

Descrever os procedimentos utilizados nas avaliações de qualidade feitas por programas de comparação entre laboratórios ou outros controles de qualidade: PNCQ-SBAC e/ou PELM-SBPC

Gerenciamento dos dados obtidos no Controle Interno e Externo

Definir como os dados de controle são arquivados e gerenciados.

Fazer referência ao manual ou POP de garantia da qualidade.

VALORES DE REFERÊNCIA

Não Aplicável.

SENSIBILIDADE E ESPECIFICIDADE

Sensibilidade Analítica

O limiar de reatividade do teste é definido na diluição recomendada de 1/32.

Sensibilidade clinica ou Diagnostica

100% de sensibilidade – Foram realizados testes em 74 amostras do controle de qualidade sabidamente positivas para toxoplasmose.

Todos os resultados foram satisfatórios, não apresentando falso-negativos.

Especificidade Diagnóstica

99,7% de especificidade – Foram realizados testes em 268 amostras do controle de qualidade sabidamente negativas para toxoplasmose.

Os resultados foram satisfatórios, apresentando apenas uma amostra falso-positiva.

LIMITAÇÕES DO MÉTODO

Amostras coletadas no início dos sintomas, quando somente anticorpos IgM estão presentes, podem apresentar resultados não reagentes para este teste.

Embora a caracterização de infecção recente deva ser determinada pela presença de anticorpos IgM específicos anti-Toxoplasma gondii, a realização do teste para IgG em duas amostras colhidas com intervalo de 8 a 14 dias e testadas em paralelo, pode determinar um aumento na concentração de IgG bastante característica de infecção recente.

Dados clínicos e epidemiológicos de cada caso juntos com outros achados sorológicos devem ser considerados sempre que possíveis.

Embora os soros controles usados no kit sejam calibrados para o soro de referência da OMS, certas discordâncias de resultados podem ser observadas quando o mesmo soro é testado por diferentes técnicas.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. Butler, W.T.: Hemagglutination studies with formalinized erythrocytes. Effect of bis-diazo-benidine and tannic acid treatment on sensitization by soluble antigen. J.Immuno. 90:663-671,1963.

2. Camargo, M.E.; Leser, P.G.:Diagnostic information from serological tests in humantoxoplasmosis as detected by hemagglutination, complement fixation, IgG-and IgM-immunofluorescence tests. Rev. Inst. Med. Trop. S.Paulo,18:227-238,1976.

3. Jacobs, L.: Serodiagnosis of toxoplasmosis. Immunology of Parasitic infections. Blackwell Scientifc Publications, Oxford, London, 94-106,1976.

4. GOLD ANALISA: Informe Técnico do Produto.

QUESTÕES

1. As condições necessárias para realização da prática foram observadas? Qual a influencia dessas condições para a realização dos experimentos?
2. Os procedimentos realizados estão de acordo com o protocolo. Comente as alterações ou adaptações realizadas
3. Relacione os matérias listados neste protocolo que não foram utilizados e quais outros materiais utilizados. Será que houve alguma falha no procedimento pela falta ou substituição do material?
4. Quais as dificuldades encontradas na realização dessa prática?
5. Os procedimentos de biossegurança foram seguidos com rigor? Quais os possíveis riscos de acidente de trabalho que os alunos e o professor sofreram? Comente sobre as normas de biossegurança.
6. Elabore 10 questões a respeito da prática ao seu professor, para melhor esclarecimento das suas dúvidas

PRÁTICA 4: FATORES INTERFERENTES NA REAÇÃO ANTIGENO – ANTICORPO

 OBJETIVO: Demonstrar os fatores interferentes na reação antígeno-anticorpo

PRINCÍPIOS: Reação de aglutinação das hemácias por anticorpos contra antígenos de superfície do grupo sangüíneo ABO e fator RH, realizadas em diferentes condições físico-quimica, onde se observa a influencia da temperatura, do pH, da concentração dos anticorpos e da força iônica.

 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA: Realize uma pesquisa sobre reação antígeno – anticorpo e os fatores interferentes.

 MATERIAL:

• 1 Seringa descartáveis de 3ml com agulha, garrote, algodão e álcool 70%
• Tubos de ensaio pequeno ( tubo de hemólise) e galeria para esses tubos
• 1 Pipetas automáticas de 500uL  com ponteiras
• 1 Pipetas automáticas de 100uL  com ponteiras
• Pipetas graduadas 1/10 de 5ml com pêra
• 500ml de Soro fisiológico,
• 10 ml Solução de NaCl a 5% e
• 10ml de solução tampão pH 5,0
• Placas de microtitulação

 PROCEDIMENTOS

1. Coletar de 1 a 2 ml de sangue venoso e separar 500uL em tubo de hemólise para proceder a lavagem de hemácias da seguinte forma:
1. No tubo com 500uL de sangue adicionar 4,5 ml de soro fisiológico,
2. Homogeneizar e centrifugar a 1500 rpm/3min.
3. Desprezar o sobrenadante e ressuspender o sedimento (hemácia) em 5ml de soro fisiológico,
4. Homogeneizar e centrifugar a 1500 rpm/3min.
5. Repetir mais uma vez a operação, ressuspender o sedimento em 2,5 ml de soro fisiológico.

2. Realizar a tipagem sanguínea da seguinte forma:
1. Enumerar 3 tubos de ensaio ( A, B e D )
2. Em cada tubo, colocar 1 gota da suspensão de hemácia
3. Colocar 1 gota do soro anti-A, anti B e anti-D, nos respectivos tubos
4. Incubar no banho-maria a 37ºC por 5min.
5. Observar aglutinação nos tubos agitando suavemente os tubos

3. Influência a temperatura na reação antígeno – anticorpo
1. Enumerar dois tubos e colocar 1 gota de suspensão de hemácia e uma gota do anti-soro correspondente ( anti-A ou anti-B ) e incubar 1 tubo a 5ºC (geladeira) e outro a temperatura ambiente ( 22 ºC) por 5min.
2. Averiguar aglutinação e comparar com o aglutinante da etapa 2 (37 ºC)

4. Influência do título do anticorpo, do pH e da força iônica
1. Em uma placa de microtitulação 100 uL de soro fisiológico nos 6 poços da primeira linha ( A); 100 uL de sol. NaCl a 5% nos 6 poços da segunda linha ( B) e 100 uL de tampão fosfato pH 5,0 nos 6 poços da terceira linha;
2. Colocar 100ul do soro anti-A ou anti-B no primeiro poço de cada linha, homogeneizar e transferir para o segundo e assim, sucessivamente até o 6 poço, obtendo assim, diluição do soro 1:2 (poço 1)  – 1:4 (poço 2) – 1:8 (poço 3)  – 1:16 (poço 4) – 1:32 (poço 5) – 1:64 (poço 6). Repetir a operação nas linhas B e C
3. Em todos os poços, adicionar 100 uL de suspensão de hemácia a 5%, homogeneizar suavemente a incubar a 37 ºC por 30 minutos.
4. Anotar os resultados

 QUESTÕES

1. Classifique os tipos de reações antígeno-anticorpo e assinale aquela demonstrada nos experimentos;
2. Analise a influência da temperatura, da concentração do anticorpo; do pH e da força iônica nas reações antígeno – anticorpo
3. Além dos fatores pesquisados que outros poderão interferir na reação antígeno-anticorpo?
4. De que forma pode-se aplicar essas informações na prática de análises clinicas
5. Os procedimentos realizados estão de acordo com o protocolo. Comente as alterações ou adaptações realizadas
6. Relacione os matérias listados neste protocolo que não foram utilizados e quais outros materiais utilizados. Será que houve alguma falha no procedimento pela falta ou substituição do material?
7. Faça comentários e ou sugestões para realização da tipagem sanguínea na rotina de análises clínicas
8. Faça a fundamentação teórica sobre reação antígeno – anticorpo, aplicação e fatores interferentes.

PRÁTICA 3: REAÇÃO DE HEMAGLUTINAÇÃO DIRETA  - TIPAGEM SANGUÍNEA

1. Objetivos: Demonstrar um tipo de reação de Hemaglutinação

2 Princípio: Reação de aglutinação das hemácias por anticorpos contra antígenos de superfície do grupo sangüíneo ABO e fator RH

3. Material: Seringa de 2ml com agulha descartável, luvas, algodão, álcool iodado, garrote, tubos com heparina ou EDTA, centrífuga, galeria de tubos, pipeta pasteur, salina, pipetas de 1ml

4. Metodologia:

·        Coletar assepticamente 1ml de sangue de 1 voluntário e transferir o sangue para tubo contendo heparina ou EDTA;

·        Fazer uma suspensão de hemácia a 10% em salina

·        Lavar as hemácias 3 vezes em salina a 1500 rpm/3min.

·        Ressuspender as hemácias com 1ml de salina

·        Enumerar 3 tubos de ensaio ( A, B e D )

·        Em cada tubo, colocar 1 gota da suspensão de hemácia

·        Colocar 1 gota do soro anti-A, anti B e anti-D, nos respectivos tubos

·        Incubar no banho-maria a 37ºC por 5min.

·        Observar aglutinação nos tubos agitando suavelmente os tubos

5. Interpretação:  Prencher a tabela abaixo, colocando (+) para reação de aglutinação e   (-)  para ausência da aglutinação. Na coluna de Resultados, colocar o referido grupo sanguíneo e o fator RH (exemplo, “A positivo”).

Voluntários	Anti-A	Anti-B	Anti-D (fator RH)	RESULTADO (grupo e fator)
Voluntário 1
Voluntário 2
Voluntário 3
Voluntário 4

QUESTÕES

1. As condições necessárias para realização da prática foram observadas? Qual a influência dessas condições para a realização dos experimentos?
2. Os procedimentos realizados estão de acordo com o protocolo. Comente as alterações ou adaptações realizadas
3. Relacione os materiais listados neste protocolo que não foram utilizados e quais outros materiais utilizados. Será que houve alguma falha no procedimento pela falta ou substituição do material?
4. Quais as dificuldades encontradas na realização dessa prática?
5. Os procedimentos de biossegurança foram seguidos com rigor? Quais os possíveis riscos de acidente de trabalho que os alunos e o professor sofreram? Comente sobre as normas de biossegurança.
6. Elabore 10 questões a respeito da prática ao seu professor, para melhor esclarecimento das suas dúvidas

PRÁTICA 2: LAVAGEM DE HEMÁCIAS

QUESTÕES

1. As condições necessárias para realização da prática foram observadas? Qual a influência dessas condições para a realização dos experimentos?
2. Os procedimentos realizados estão de acordo com o protocolo. Comente as alterações ou adaptações realizadas
3. Relacione os materiais listados neste protocolo que não foram utilizados e quais outros materiais utilizados. Será que houve alguma falha no procedimento pela falta ou substituição do material?
4. Quais as dificuldades encontradas na realização dessa prática?
5. Os procedimentos de biossegurança foram seguidos com rigor? Quais os possíveis riscos de acidente de trabalho que os alunos e o professor sofreram? Comente sobre as normas de biossegurança.
6. Elabore 10 questões a respeito da prática ao seu professor, para melhor esclarecimento das suas dúvidas

PRÁTICA 1: PROCESSAMENTO DE AMOSTRAS PARA EXAME IMUNOLÓGICO

COLETA DE AMOSTRAS - http://www.lacen.pa.gov.br/?q=node/256

A coleta de sangue está descrita a seguir e a coleta das demais amostras está descrita nos capítulos relativos, de acordo com as orientações para cada tipo de exame.

2.3.1. Coleta de Sangue

a) Se o paciente estiver em condições de mobilidade normais, sentá-lo confortavelmente em cadeira com descanso para o braço, deixando-o acessível para a coleta. Caso não esteja, colher com o paciente deitado;

b) Antes de iniciar a coleta, lavar as mãos, calçar luvas, identificar os tubos, encaixar a agulha na seringa, inspecionar a ponta da agulha (não deve estar rombuda ou torta) e mover o êmbolo da seringa;

c) Se a coleta for a vácuo, rosquear a agulha no suporte;

d) Colocar o torniquete (garrote) para que as veias fiquem mais salientes;

e) Inspecionar as veias cuidadosamente e verificar a mais adequada para a punção;

f) Fazer a assepsia do local com algodão embebido em álcool 70%;

g) Em seguida, puncionar a veia e coletar o sangue;

h) A coleta deve ser, preferencialmente, a vácuo, cuidar para não retirar o tubo enquanto tiver vácuo, para que a quantidade de sangue produza a quantidade de soro ou plasma necessários;

i) A pressão do torniquete não deve ser mantida mais que 60 segundos, porque produz aumentos na concentração de células sanguíneas;

j) Se a coleta for com seringa, colocar o sangue, cuidadosamente nos tubos próprios, deixando escorrer suavemente pela parede interna do tubo;

k) Se a coleta for a vácuo, colher nos tubos próprios para os exames.

2.4. PREPARO DA AMOSTRA

2.4.1. Separação do Soro ou Plasma

a) Calçar luvas;

b) Colocar as amostras em Banho Maria a 37°C para retração de coágulo.

Tempo: 15 minutos.

c) Abrir a centrífuga, colocar os tubos com o sangue nas “caçapas”, tomando o cuidado de equilibrá-los;

d) Fechar a tampa da centrífuga, marcar 3000 a 4000 RPM e ligar por 5 minutos;

e) Não abrir a tampa da centrífuga antes de parar totalmente de rodar e nem tentar parar com a mão ou instrumentos (recomenda-se não abrir a centrífuga imediatamente após parar, devido formação de aerossóis que podem ser infectantes, por isto, deve-se esperar alguns minutos para que as partículas sedimentem);

f) Retirar os tubos das caçapas com auxílio de uma pinça e colocar em estante própria;

g) Verificar o aspecto da amostra. O soro ou plasma deve estar livre de resíduos de hemácias.

Se o soro estiver fortemente hemolisado ou lipêmico, nova coleta deve ser providenciada;

h) Vedar bem, mas apenas na borda da tampa, com fita crepe (evitar o uso de esparadrapo).

2.5. IDENTIFICAÇÃO DA AMOSTRA

Qualquer amostra deve vir identificada com etiqueta autocolante, em letra legível, contendo: nome do paciente, idade, sexo, tipo de exame, local de procedência.

Nota:

A etiqueta deve ser colocada de maneira que se possa visualizar a amostra, não colocar a etiqueta na tampa. Se for amostra líquida (sangue total, soro, plasma) o nível da amostra não deve ficar coberto.

QUESTÕES

1. As condições necessárias para realização da prática foram observadas? Qual a influencia dessas condições para o Imunodiagnóstico?
2. Os procedimentos realizados estão de acordo com o protocolo. Comente as alterações ou adaptações realizadas
3. Relacione os matérias listados neste protocolo que não foram utilizados e quais outros materiais utilizados. Será que houve alguma falha no procedimento pela falta ou substituição do material?
4. Quais as dificuldades encontradas na realização dessa prática?
5. Os procedimentos de biossegurança foram seguidos com rigor? Quais os possíveis riscos de acidente de trabalho que os alunos e o professor sofreram? Comente sobre as normas de biossegurança.
6. Quais as orientações ao paciente que se deve dar antes e após a coleta de sangue?
7. Elabore 10 questões a respeito da prática ao seu professor, para melhor esclarecimento das suas dúvidas
8.