1) Coleta de sangue Click aqui para mais detalhes
2) Separação do plasma
3) Preparo da suspensão de hemácia a 5%
4) Lavagem de hemácia - purificação dos aglutinógenos
5) Tipagem sanguínea Click aqui para Roteiro Prático
6) Diluição seriada do plasma
7) Reação de aglutinação e sedimentação em microplacas
8) Prova cruzada sanguínea
9) Imunoprecipitação em gel Click aqui - Roteiro de prática
COLETA DE AMOSTRAS - http://www.lacen.pa.gov.br/?q=node/256
A coleta de sangue está descrita a seguir e a coleta das demais amostras está descrita nos capítulos relativos, de acordo com as orientações para cada tipo de exame.
2.3.1. Coleta de Sangue
a) Se o paciente estiver em condições de mobilidade normais, sentá-lo confortavelmente em cadeira com descanso para o braço, deixando-o acessível para a coleta. Caso não esteja, colher com o paciente deitado;
b) Antes de iniciar a coleta, lavar as mãos, calçar luvas, identificar os tubos, encaixar a agulha na seringa, inspecionar a ponta da agulha (não deve estar rombuda ou torta) e mover o êmbolo da seringa;
c) Se a coleta for a vácuo, rosquear a agulha no suporte;
d) Colocar o torniquete (garrote) para que as veias fiquem mais salientes;
e) Inspecionar as veias cuidadosamente e verificar a mais adequada para a punção;
f) Fazer a assepsia do local com algodão embebido em álcool 70%;
g) Em seguida, puncionar a veia e coletar o sangue;
h) A coleta deve ser, preferencialmente, a vácuo, cuidar para não retirar o tubo enquanto tiver vácuo, para que a quantidade de sangue produza a quantidade de soro ou plasma necessários;
i) A pressão do torniquete não deve ser mantida mais que 60 segundos, porque produz aumentos na concentração de células sanguíneas;
j) Se a coleta for com seringa, colocar o sangue, cuidadosamente nos tubos próprios, deixando escorrer suavemente pela parede interna do tubo;
k) Se a coleta for a vácuo, colher nos tubos próprios para os exames.
2.4. PREPARO DA AMOSTRA
2.4.1. Separação do Soro ou Plasma
a) Calçar luvas;
b) Colocar as amostras em Banho Maria a 37°C para retração de coágulo.
Tempo: 15 minutos.
c) Abrir a centrífuga, colocar os tubos com o sangue nas “caçapas”, tomando o cuidado de equilibrá-los;
d) Fechar a tampa da centrífuga, marcar 3000 a 4000 RPM e ligar por 5 minutos;
e) Não abrir a tampa da centrífuga antes de parar totalmente de rodar e nem tentar parar com a mão ou instrumentos (recomenda-se não abrir a centrífuga imediatamente após parar, devido formação de aerossóis que podem ser infectantes, por isto, deve-se esperar alguns minutos para que as partículas sedimentem);
f) Retirar os tubos das caçapas com auxílio de uma pinça e colocar em estante própria;
g) Verificar o aspecto da amostra. O soro ou plasma deve estar livre de resíduos de hemácias.
Se o soro estiver fortemente hemolisado ou lipêmico, nova coleta deve ser providenciada;
h) Vedar bem, mas apenas na borda da tampa, com fita crepe (evitar o uso de esparadrapo).
2.5. IDENTIFICAÇÃO DA AMOSTRA
Qualquer amostra deve vir identificada com etiqueta autocolante, em letra legível, contendo: nome do paciente, idade, sexo, tipo de exame, local de procedência.
Nota:
A etiqueta deve ser colocada de maneira que se possa visualizar a amostra, não colocar a etiqueta na tampa. Se for amostra líquida (sangue total, soro, plasma) o nível da amostra não deve ficar coberto.
QUESTÕES
- As condições necessárias para realização da prática foram observadas? Qual a influencia dessas condições para o Imunodiagnóstico?
- Os procedimentos realizados estão de acordo com o protocolo. Comente as alterações ou adaptações realizadas
- Relacione os matérias listados neste protocolo que não foram utilizados e quais outros materiais utilizados. Será que houve alguma falha no procedimento pela falta ou substituição do material?
- Quais as dificuldades encontradas na realização dessa prática?
- Os procedimentos de biossegurança foram seguidos com rigor? Quais os possíveis riscos de acidente de trabalho que os alunos e o professor sofreram? Comente sobre as normas de biossegurança.
- Quais as orientações ao paciente que se deve dar antes e após a coleta de sangue?
- Elabore 10 questões a respeito da prática ao seu professor, para melhor esclarecimento das suas dúvidas
Determinação Sangüínea ABO : A importante descoberta de que as hemácias humanas pertenciam a diferentes grupos sangüíneos foi realizada por Landsteiner em 1900, que identificou o sistema ABO. Este sistema foi então dividido em quatro grupos sangüíneos: A, B, AB e O; onde os indivíduos classificados como:
"A" possuem aglutinógenos A nas hemácias e anticorpos contra B no plasma. "B" possuem aglutinógenos B nas hemácias e anticorpos contra A no plasma. "AB” possuem aglutinógenos A e B nas hemácias e não possuem anticorpos no plasma. "O" não possuem aglutinógenos nas hemácias e possuem anticorpos contra A e B no plasma. Para a determinação do tipo sangüíneo utilizamos a pesquisa de aglutinógenos nas hemácias(tipagem Direta), e para a confirmação destes mesmos grupos sangüíneos realizamos a tipagem Reversa, onde detectaremos os seus respectivos anticorpos. Na tabela a seguir poderemos observar a relação existente entre aglutinógenos e anticorpos correspondentes nos respectivos grupos sangüíneos. |
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Determinação do fator Rh : O fator Rh foi descoberto em 1940 por Landsteiner e Wiener. À partir daí foram descobertos aproximadamente 40 ou mais aglutinógenos diferentes no sistema Rh, porém na prática procura-se determinar a presença ou ausência de um deles, especificamente o aglutinógeno D. A presença do aglutinógeno "D" irá caracterizar o indivíduo como Rh Positivo e sua ausência como Rh Negativo
Teste da Antiglobulina Direto(Coombs Direto) : A principal finalidade deste teste é a detecção de hemácias revestidas de anticorpos, ou seja, hemácias sensibilizadas "in vivo". Ë muito utilizado na investigação de reações transfusionais, no diagnóstico de doença hemolítica perinatal e de anemias hemolíticas auto-imunes.
Teste da Antiglobulina Indireto(Coombs Indireto) : Consiste na Pesquisa de Anticorpos Irregulares(P.A.I.), onde iremos determinar a ausência ou a presença de anticorpos livres no soro ou plasma de doadores e pacientes.
Quando obtivermos um P.A.I. Positivo, será indicativo da presença de um anticorpo irregular no plasma deste paciente ou doador de sangue, o que nos levará a realização de um outro teste denominado de Identificação de Anticorpos Irregulares(I.A.I.), onde iremos determinar a especificidade deste anticorpo, ou seja, contra que aglutinógeno específico este anticorpo é voltado.
Provas de Compatibilidade : As provas de compatibilidade pré-transfusionais, também denominadas de " provas cruzadas", são realizadas com o intuito de confirmar se o sangue a ser transfundido é realmente compatível com o do receptor. Deve-se observar rigorosamente a tipagem ABO, visto que a maioria dos acidentes transfusionais graves ocorrem por este tipo de incompatibilidade.
Abaixo iremos demonstrar um esquema que pode ser utilizado nas transfusões de concentrado de hemácias. |
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Material: Seringa de 2ml com agulha descartável, luvas, algodão, álcool iodado, garrote, tubos com heparina ou EDTA, centrífuga, galeria de tubos, pipeta pasteur, salina, pipetas de 1ml
Metodologia:· Coletar assepticamente 1ml de sangue de 1 voluntário e transferir o sangue para tubo contendo heparina ou EDTA;· Fazer uma suspensão de hemácia a 10% em salina· Lavar as hemácias 3 vezes em salina a 1500 rpm/3min.· Ressuspender as hemácias com 1ml de salina· Enumerar 3 tubos de ensaio ( A, B e D )· Em cada tubo, colocar 1 gota da suspensão de hemácia· Colocar 1 gota do soro anti-A, anti B e anti-D, nos respectivos tubos· Incubar no banho-maria a 37ºC por 5min.· Observar aglutinação nos tubos agitando suavelmente os tubos
Metodologia:· Coletar assepticamente 1ml de sangue de 1 voluntário e transferir o sangue para tubo contendo heparina ou EDTA;· Fazer uma suspensão de hemácia a 10% em salina· Lavar as hemácias 3 vezes em salina a 1500 rpm/3min.· Ressuspender as hemácias com 1ml de salina· Enumerar 3 tubos de ensaio ( A, B e D )· Em cada tubo, colocar 1 gota da suspensão de hemácia· Colocar 1 gota do soro anti-A, anti B e anti-D, nos respectivos tubos· Incubar no banho-maria a 37ºC por 5min.· Observar aglutinação nos tubos agitando suavelmente os tubos
Interpretação: Preencher a tabela abaixo, colocando (+) para reação de aglutinação e (-) para ausência da aglutinação. Na coluna de Resultados, colocar o referido grupo sanguíneo e o fator RH (exemplo, “A positivo”).
QUESTÕES
Voluntários
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Anti-A
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Anti-B
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Anti-D (fator RH)
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RESULTADO
(grupo e fator)
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Voluntário 1
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Voluntário 2
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Voluntário 3
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Voluntário 4
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QUESTÕES
- As condições necessárias para realização da prática foram observadas? Qual a influência dessas condições
- Os procedimentos realizados estão de acordo com o protocolo. Comente as alterações ou adaptações realizada
- Relacione os materiais listados neste protocolo que não foram utilizados e quais outros materiais utilizados. Será que houve alguma falha no procedimento pela falta ou substituição do material?
- Quais as dificuldades encontradas na realização dessa prática?
- Os procedimentos de biossegurança foram seguidos com rigor? Quais os possíveis riscos de acidente de trabalho que os alunos e o professor sofreram? Comente sobre as normas de biossegurança.
- Elabore 10 questões a respeito da prática ao seu professor, para melhor esclarecimento das suas dúvidas
IMUNOPRECIPITAÇÃO EM GEL (SEG. OUCHTERLONY)
1. Objetivos: Averiguar uma reação de precipitação; fazer a comparação direta de vários antígenos e antissoros e estudar as reações cruzadas entre antígenos
2. Princípio: Tanto o antissoro quanto o antígeno solúvel se difundem no ágar e na zona de equilibrio das concentrações (Ag x Ac) forma um precipitado que é visto em forma de uma linha.. A precipitação em gel de ágar é amplamente utilizada em imunologia de diagnóstico. Ela é particularmente útil na quantificação de concentrações de imunoglobulinas e na imunoeletroforese. Na imunoquantificação, o ágar é impregnado por antissoro e o material a ser testado é colocado em orifícios. Os diâmetros dos anéis concêntricos de precipitação que se formam são diretamente proporcionais à concentração do antígeno em questão. Estas técnicas são úteis na quantificação de imunoglobulinas em muitos estudos epidemiológicos, como as doenças imunoproliferativas e as deficiências imunológicas.
4. Material: Lâmina de microscópio, agarose a 1% preparado salina (contendo mertiolato a 0,01% ou ázida sódica a 0,1%), Citrato de sódio a 5%, Corante Coomasie Blue Brilhante R a 0,15g%, Solução descorante (20ml de ácido acético glacial+40ml Etanol+40ml de água), molde para perfurar os orifícios; pipeta Pasteur; antissoro; antígeno;
5. Metodologia:
· Recobrir uma lâmina de microscópio com agarose 0,1%(em água) e deixar secar na estufa;
· Depositar nessa lâmina cerca de 5ml de agarose a 1% preparado em salina (contendo mertiolato a 0,01% ou ázida sódica a 0,1%) até obter camada de 3mm de espessura;
· Esperar solidificar e praticar, com um molde, 1 orifício (3mm de diâmetro) na região central e 3 ou mais em torno do orifício central, de modo que a distância entre os orifícios da circunferência e o central seja aproximadamente 10mm;
· Colocar o antissoro (10mL) no orifício central e os antígenos em diferentes diluições, nos orificios periféricos. Pode-se, também, proceder de modo inverso;
· Conservar as lâminas em câmara úmida, no refrigerador, ou a uma outra temperatura constante e observar a formação das linhas de precipitação durante 24 a 48 horas ou mais;
· Lavar 1hora com citrato de sódio a 5% e deixar em salina durante 24 horas, fazendo-se 3 a 4 trocas;
· Envolver em papel de filtro umedecido em água e secar a 37ºC “overnight”
· Lavar com água para retirar fragmentos do papel de filtro sobre o gel
· Corar com Coomasie Blue Brilhante R durante 5min. Descorar com solução descorante, para se obter visualização das linhas de precipitação
6. Interpretação: Averiguar a formação de linhas de precipitação. De acôrdo com o parentesco imunológico dos antígenos empregados, quatro tipo básicos de precipitação podem formar-se nas placas de Ouchterlony: (a) Tipo I – reação de identidade; b) Tipo II – reação de não identidade; c) Tipo III – reação de identidade parcial; d) Tipo IV – reação de inibição.
QUESTÕES
- As condições necessárias para realização da prática foram observadas? Qual a influência desssas condições para o Imunodiagnóstico?
- Os procedimentos realizados estão de acordo com o protocolo. Comente as alterações ou adaptações realizadas
- Relacione os materiais listados neste protocolo que não foram utilizados e quais outros materiais utilizados. Será que houve alguma falha no procedimento pela falta ou substituição do material?
- Quais as dificuldades encontradas na realização dessa prática?
- Os procedimentos de biossegurança foram seguidos com rigor? Quais os possíveis riscos de acidente de trabalho que os alunos e o professor sofreram? Comente sobre as normas de biossegurança.
- Quais as orientações ao paciente que se deve dar antes e após a coleta de sangue?
- Elabore 10 questões a respeito da prática ao seu professor, para melhor esclarecimento das suas dúvidas
