Relatórios 01/2014

NESSE ESPAÇO DEVE SER POSTADO OS RELATÓRIOS DAS AULAS PRÁTICAS, ONDE OS ALUNOS SÃO ORIENTADOS A RESPONDEREM O QUESTIONÁRIO PROPOSTO EM CADA PRÁTICA, AS FOTOS E AS DEVIDAS OBSERVAÇÕES.




GRUPO: AGLAUPY RAIO-DE-LUAR VITAL FERREIRA SILVA SOUZA BRASIL;
JESSICA SOUSA; MARCOS VIEIRA; PABLO CASTRO GOMES; TUANY RODRIGUES ASSAD MACIEL; VALBER PEREIRA FERREIRA; WILANY TAVARES

Aula prática 1 – 24 de janeiro de 2014
Processamento de amostra – Separação de plasma
1. Introdução
O plasma sanguíneo é componente líquido do sangue, no qual as células sanguíneas encontram-se suspensas. Apresenta coloração amarelada e corresponde a aproximadamente 55% do volume sanguíneo total. Uma das técnicas mais simples para separar a parte líquida do sangue (plasma) da parte sólida, é através da centrifugação. O soro, obtido por meio da coagulação sanguínea, corresponde ao plasma sanguíneo sem os fatores de coagulação, como, por exemplo, a fibrina. Esta porção do sangue tipicamente é utilizada em testes sorológicos que visam pesquisar a presença de determinados anticorpos.

2. Objetivo
Processar a amostra de sangue para a separação do plasma.
3. Materiais: EPI’s;, Seringa de 3 mL com agulha descartável; Garrote; Tubos de ensaio; Álcool 70%; Algodão; Centrífuga; Pinça; Grade.

4. Procedimentos
4.1 Coleta de sangue
- Primeiramente observou-se se o paciente estava em condições de mobilidade normais, o mesmo sentou-se confortavelmente em cadeira com descanso para o braço, deixando-o acessível para a coleta;
- Antes de iniciar a coleta, lavou-se as mãos, calçou-se luvas, identificou-se os tubos, encaixou-se a agulha na seringa, inspecionou-se a ponta da agulha (não deve estava rombuda ou torta) e moveu-se o êmbolo da seringa;
- Colocou-se o torniquete (garrote) para que as veias ficassem mais salientes, em seguida inspecionaram-se as veias cuidadosamente e verificou-se a mais adequada para a punção;
- Foi feita a assepsia do local com algodão embebido em álcool 70%, em seguida, puncionou-se a veia e coletou-se o sangue;
- A pressão do torniquete não deve ser mantida mais que 60 segundos, porque produz aumentos na concentração de células sanguíneas;
- Colocou-se o sangue, cuidadosamente nos tubos próprios, deixando escorrer suavemente pela parede interna do tubo;
4.2 Preparo da amostra
4.2.1 Separação do soro ou plasma
- Calçaram-se as luvas;
- Foi aberta a centrífuga, colocaram-se os tubos com o sangue nas “caçapas”, tomando o cuidado de equilibrá-los;
- Fechou-se a tampa da centrífuga, marcou-se 3000 a 4000 RPM e foi ligada por 5 minutos;
- Não se deve abrir a tampa da centrífuga antes de parar totalmente de rodar e nem tentar parar com a mão ou instrumentos (recomenda-se não abrir a centrífuga imediatamente após parar, devido formação de aerossóis que podem ser infectantes, por isto, deve-se esperar alguns minutos para que as partículas sedimentem);
- Os tubos foram retirados das caçapas com auxílio de uma pinça e colocou-os na grade;
- Verificou-se o aspecto da amostra. O soro ou plasma estava livre de resíduos de hemácias;
- Caso o soro estivesse fortemente hemolisado ou lipêmico, uma nova coleta deveria ser providenciada;

Fig. 1: Separação do plasma

4.2.2 Identificação da amostra

- A amostra estava identificada com etiqueta autocolante, em letra legível, contendo: nome do paciente, idade, sexo, tipo de exame, local de procedência.

5. Resultado

Na prática obteve-se a separação do plasma e o soro a partir da centrifugação do sangue, o mesmo foi utilizado para a prática posterior.

6. Questões

a) As condições necessárias para realização da prática foram observadas? Qual a influência dessas condições para o imunodiagnóstico? Sim. As condições influenciam diretamente no resultado final, caso estejam fora do necessário (correto) obtém-se resultados negativos e fora dos padrões.

b) Os procedimentos realizados estão de acordo com o protocolo? Comente as alterações ou adaptações realizadas.  Não. Fazendo uma correlação com o protocolo disponibilizado no blog do Prof. Luis Carlos Carvalho, foram feitas algumas alterações como: na coleta não foi utilizado o vácuo e sim da seringa, para a separação do soro ou plasma as amostras não foram colocadas no banho-maria e a tampa do tubo não foi vedada com fita crepe, pois a amostra seria utilizada para a próxima prática.

c) Relacione os materiais listados neste protocolo que não foram utilizados e quais outros materiais utilizados. Será que houve alguma falha no procedimento pela falta ou substituição do material?

Não foram utilizados o tubo à vácuo, o banho-maria e a fita crepe; não há outros materiais a serem usados. Suponhamos que a utilização da seringa ao invés do vácuo para coleta resultou em pouca amostra se compararmos as duas técnicas. Quanto à não utilização do banho-maria na fase de separação do soro ou plasma e não ter vedado a tampa do tubo com fita crepe não interferiu no resultado.

d) Quais as dificuldades encontradas na realização dessa prática?  Não houveram dificuldades.

e) Os procedimentos de biossegurança foram seguidos com rigor? Quais os possíveis riscos de acidente de trabalho que os alunos e o professor sofreram? Comente sobre as normas de biossegurança.

Sim. Devido termos seguido os procedimentos de biossegurança com rigor, os alunos e o professor não sofreram quaisquer riscos de acidente de trabalho. As normas de biossegurança são:

- Utilização dos EPI’s;

- Não manusear materiais biológicos, reagentes e materiais perfurocortantes próximo aos olhos;

- Seguir os procedimentos com rigor, a fim de prevenir possíveis riscos.

f) Quais as orientações ao paciente que se deve dar antes e após a coleta de sangue?

Antes deve-se verificar se o paciente está em jejum, se faz uso de algum medicamento, ao garrotear o braço pedir que ele feche a mão e após a punção pedir que ele a abra. Após a coleta deve-se verificar se o paciente está bem, pedir para o mesmo segurar o algodão sem apertar e esfregar, não dobrar o braço, aguardar alguns instantes para se levantar e disponibilizar um lanche.

g) Elabore 10 questões a respeito da prática ao seu professor, para melhor esclarecimento das suas dúvidas.

Não houveram dúvidas.

GRUPO: AGLAUPY RAIO-DE-LUAR VITAL FERREIRA SILVA SOUZA BRASIL;
JESSICA SOUSA; MARCOS VIEIRA; PABLO CASTRO GOMES; TUANY RODRIGUES ASSAD MACIEL; VALBER PEREIRA FERREIRA; WILANY TAVARES

Aula prática 4 – 31 de janeiro de 2014

Fatores interferentes na reação antígeno-anticorpo

Introdução.  Interação Antígeno-Anticorpo é uma associação biomolecular semelhante à interação de enzimas com seus substratos ou de hormônios com seus receptores, com uma distinção bem evidente o Anticorpo (Ac) não provoca nenhuma alteração química irreversível na molécula de Antígeno (Ag), podendo, portanto, o produto formado (Ag-Ac) se dissociar nos seus 2 componentes Ag e Ac livres/solução/suspensão.

A interação entre Antígeno-Anticorpo envolve a ocorrência de várias forças não covalentes entre o determinante antigênico (epítopo) da molécula do Ag e o sítio combinatório (parátopo) da molécula do Ac, constituído pelas regiões (domínios) variáveis de cadeia L e de cadeia H (VL / VH) e particularmente pelas regiões hipervariáveis ou regiões determinantes de complementaridade (CDRs) de VH e de VL.

2. Objetivo : Demonstrar os fatores interferentes na reação antígeno-anticorpo.

3. Princípio

Reação de aglutinação das hemácias por anticorpos contra antígenos de superfície do grupo sanguíneo ABO e fator RH, realizadas em diferentes condições físico-químicas, onde se observa a influencia da temperatura, do pH, da concentração dos anticorpos e da força iônica.

4. Materiais :  1 seringa descartável de 3ml com agulha, garrote, algodão e álcool 70%;

- Tubos de ensaio pequenos e grade para esses tubos;   1 pipeta automática de 500uL com ponteiras;   1 pipeta automática de 100uL com ponteiras;   Pipetas graduadas 1/10 de 5ml com pêra;   500 ml de Solução fisiológica; 10 ml de Solução de NaCl a 5% e 10ml de solução tampão pH 5,0;  Placas de microtitulação.

5. Procedimento

- Após ter realizado a coleta do sangue venoso, a separação do plasma, a lavagem de hemácia e a tipagem sanguínea, foi feita com a mesma amostra esta prática:

5.1 Influência da temperatura na reação antígeno – anticorpo

- Enumeramos dois tubos e colocou-se 1 gota de suspensão de hemácia (Hc lavada) e uma gota do anti-soro correspondente (anti-A) e incubou-se 1 tubo a 5⁰C (geladeira) e outro a temperatura ambiente ( 25⁰C) por 5 minutos;

- Logo após retirou-se as amostras e levou-as para centrífuga por 1 minuto;

- A aglutinação foi observada e comparada com o aglutinante da etapa 2 (37⁰C).

5.2 Influência do título do anticorpo, do pH e da força iônica

- Em uma placa de microtitulação foram pipetados 100 μL de Solução fisiológica e adicionados nos 6 poços da primeira linha (A); 100 μL de sol. NaCl a 5% nos 6 poços da segunda linha (B) e 100 μL de Ácido acético 1% pH 2 nos 6 poços da terceira linha;

- Colocou-se 100 μL do soro anti-A no primeiro poço de cada linha, homogeneizou-o e transferiu-o para o segundo e assim, sucessivamente até o sexto poço, obtendo assim, diluição do soro 1:2 (poço 1) – 1:4 (poço 2) – 1:8 (poço 3) – 1:16 (poço 4) – 1:32 (poço 5) – 1:64 (poço 6). Repetiu-se a operação nas linhas B e C;

- Em todos os poços, foram adicionados 100 μL de suspensão de hemácia sem diluição, depois homogeneizado suavemente a incubado a 37⁰C por 30 minutos.

OBS.: As hemácias lavadas foram colocadas a partir do primeiro poço e a prática foi feita em 12 poços em proporção de diluição 1:2, 1:4, 1:6, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64, 1:128, 1:256, 1:512,

Fig. 5: Placa de microtitulação com reprodução dos resultados

8. Questões
a) Classifique os tipos de reações antígeno-anticorpo e assinale aquela demonstrada nos experimentos.
Aglutinação, precipitação, floculação celular, fixação de complemento, neutralização, imunofluorescência, separação eletroforética de proteínas – SDS/PAGE.
A demonstrada nos procedimentos é a Reação de aglutinação (tipagem sanguínea).
b) Analise a influência da temperatura; da concentração do anticorpo, do pH e da força iônica nas reações antígeno-anticorpo.  Temperatura: a reação de aglutinação não foi influenciada pela mesma, sendo realizada em refrigeração e temperatura ambiente. Concentração do anticorpo, pH e força iônica: não houve influência dos mesmos sobre a reação de aglutinação.
c) Além dos fatores pesquisados que outros poderão interferir na reação antígeno-anticorpo?
Afinidade. Avidez: reações entre Ac e Ag multivalentes são mais fáceis de detectar.
d) De que forma pode-se aplicar essas informações na prática de análises clinicas?
É necessário que se apliquem essas informações para que não haja se possa liberar um resultado errôneo e evitar perca de material, mantendo a qualidade do laboratório.
e) Os procedimentos realizados estão de acordo com o protocolo? Comente as alterações ou adaptações realizadas. Não. No protocolo o procedimento da técnica de Influência do título do anticorpo, do pH e da força iônica houve alteração de invés de utilizar NaCl a 5% utilizou-se a 10% e invés de usar o tampão fosfato pH 5,0 utilizou-se Ác. Acético a 1% e pH 2,0.
f) Relacione os materiais listados neste protocolo que não foram utilizados e quais outros materiais utilizados. Será que houve alguma falha no procedimento pela falta ou substituição do material?
Nesta prática não houve utilização de outros materiais além dos listados no protocolo. Não houve falha no procedimento por falta ou substituição de material, pois não houve falta ou substituição de material.
g) Faça comentários e ou sugestões para realização da tipagem sanguínea na rotina de análises clínicas.
A Tipagem Sanguínea é um teste simples, de fácil manuseamento e interpretação, toda via de grande importância, o mesmo segue um protocolo de Normas Técnicas que é padronizado.
h) Faça a fundamentação teórica sobre reação antígeno-anticorpo, aplicação e fatores interferentes.
São utilizadas partículas ligadas a antígenos ou anticorpos que reagem com um analito produzindo uma reação visível a olho nu ou ao microscópio. Na maioria dos formatos analíticos as reações positivas se manifestam por presença de aglutinação. Em algumas reações de aglutinação utiliza-se o modelo na inibição de aglutinação e as reações positivas se manifestam pela ausência de aglutinação. Exame útil para a determinação do tipo sanguíneo antes de transfusão, perfil pré-natal para aconselhamento, preparo pré-operatório, na suspeita de incompatibilidade materno-fetal e na seleção de gestantes para imunoterapia anti-D (prevenção de sensibilização quando o feto é D positivo). As interferências, conforme já foi salientado nas primeiras questões, podem ser desde fatores como pH, concentração do anticorpo, manuseamento indevido de reagentes e amostras, entre outros

GRUPO: AGLAUPY RAIO-DE-LUAR VITAL FERREIRA SILVA SOUZA BRASIL;
JESSICA SOUSA; MARCOS VIEIRA; PABLO CASTRO GOMES; TUANY RODRIGUES ASSAD MACIEL; VALBER PEREIRA FERREIRA; WILANY TAVARES

Aula prática 5 – 7 de fevereiro de 2014

Reação de hemaglutinação indireta para Toxoplasmose

1. Introdução

A toxoplasmose é uma zoonose de distribuição mundial, doença infecciosa congênita ou adquirida, causada pelo protozoário Toxoplasma gondii. Como ele parasita todas as células nucleares, as manifestações clinicas podem ser muito variáveis, tais como: coriorretinites, miocardites, pericardites, pneumonias, miosites, meningoencefalites e hepatites. A interpretação dos resultados da imunofluorescência indireta na caracterização de ausência de infecção atual ou pregressa deve ser baseada na presença ou ausência de anticorpos IgG e IgM anti-toxoplasma. Os principais métodos laboratoriais para o diagnóstico da toxoplasmose são a imunofluorescência indireta (IFI), a hemaglutinação passiva (HAI) e os ensaios imunoenzimáticos (ELISA).2. Objetivo:?

Realizar hemaglutinação indireta para identificar/confirmar toxoplasmose.

3. Fundamento: Eritrócitos estabilizados de aves e sensibilizados com componentes antigênicos do Toxoplasma gondii altamente purificados são aglutinados pelos anticorpos anti-Toxoplasma gondii presentes na amostra analisada.

4. Aplicação clínica:  A toxoplasmose é uma zoonose de distribuição mundial, doença infecciosa congênita ou adquirida, causada pelo protozoário Toxoplasma gondii. Como ele parasita todas as células nucleares, as manifestações clinicas podem ser muito variáveis, tais como: coriorretinites, miocardites, pericardites, pneumonias, miosites, meningoencefalites e hepatites.

O problema mais sério que resulta da infecção por Toxoplasma gondii é a transmissão congênita do parasita ao feto durante a gravidez. O comprometimento fetal severo pode acarretar a morte do feto, a morte do recém nascido ou a enfermidade congênita, expressada por uma tríade de sintomas: hidrocefalia ou microcefalia, coriorretinite e calcificação cerebral.

A transmissão congênita transplacentária da toxoplasmose depende basicamente da existência de infecções agudas na etapa gestacional. Quanto menor a idade gestacional, maior o risco de comprometimento fetal, sendo que o comprometimento mais grave ocorre no primeiro trimestre da gestação.

O diagnóstico da toxoplasmose jamais poderá ser estabelecido com base em dados puramente clínicos. Há sempre necessidade da confirmação laboratorial e correta interpretação dos resultados. A interpretação dos resultados da imunofluorescência indireta na caracterização de ausência de infecção atual ou pregressa deve ser baseada na presença ou ausência de anticorpos IgG e IgM anti-toxoplasma. Os principais métodos laboratoriais para o diagnóstico da toxoplasmose são a imunofluorescência indireta (IFI), a hemaglutinação passiva (HAI) e os ensaios imunoenzimáticos (ELISA).

5. Amostra:  Preparo do Paciente:

- Colher sangue pela manhã após jejum de 8 horas, salvo orientações médicas.

Amostras utilizadas:

- Soro. (Usar soros frescos ou conservados a -20 ºC de pacientes em jejum; Não usar soro hemolisado, contaminado ou lipêmico);

- Evitar o congelamento e descongelamento repetido do soro;

Volume ideal utilizado para análise:

- Definir o volume ideal a ser encaminhado para análise.

Volume mínimo utilizado para análise:

- Definir o volume mínimo a ser encaminhado para análise.

6. Materiais: Placa de microtitulação; Pipeta automática de 100 μL e 20 μL junto à ponteiras; Grade para colocar a solução fisiológica;

7. Reagentes: Diluente do Kit; Controle positivo;Controle negativo: solução fisiológica; - Anti-A: para sangue do tipo B;  Anti-B: para sangue do tipo A;  Hemácia sensibilizada.

8. Procedimento

- Primeiramente a bancada foi organizada e a equipe se paramentou com os EPI’s;

- Em um tubo de ensaio foi colocada a solução fisiológica que seria posteriormente micropipetada;

- Em uma grade foram colocados os tubos de ensaio com solução fisiológica e com a amostra;

- Em placa de microtitulação foram utilizados 4 poços, sendo A1, A2, A3 e A4;

- Primeiramente, colocou-se a placa sobre um papel toalha para neutralizar as forças eletrostáticas e em todos os poços foram adicionados 100 μL do diluente;

- Em seguida, no poço A1 foram adicionados 20 μL do Controle positivo e 40 μL de Hc sensibilizadas;

- No poço A2 foram adicionados 20 μL do reagente Anti-B (respectivo ao grupo A da prática) e 40 μL de Hc sensibilizadas;

- No poço A3 foram adicionados 20 μL do reagente Anti-A (respectivo ao nosso grupo B) e 40 μL de Hc sensibilizadas;

- No poço A4 foram adicionados 20 μL do Controle negativo e 40 μL de Hc sensibilizadas.

OBS.: Nesta prática foi utilizada a amostra reservada das práticas anteriores.

Fig. 6: Procedimento. Pipetagem das hemácias sensibilizadas.

Leitura e interpretação dos resultados

Reação Negativa: as hemácias se depositam no fundo da cavidade com um formato semelhante a um botão. Significa ausência de anticorpos específicos anti-Toxoplasma gondii ou que estes existem abaixo do limite de detecção.

Reação Positiva: as hemácias se depositam no fundo da cavidade como um tapete, às vezes com bordas irregulares. Significa presença de anticorpos específicos anti-Toxoplasma gondii.

10.Resultado

Houve ausência de anticorpos específicos anti-Toxoplasma gondii para os dois tipos sanguíneos, identificado pelo fato de as Hc terem se depositado no fundo da cavidade semelhante a um botão.

Nota: soros que dão reação negativa são informados como Não Reagentes, significando ausência de infecção atual ou pregressa para toxoplasmose.

11.Questões

a) As condições necessárias para realização da prática foram observadas? Qual a influencia dessas condições para a realização dos experimentos? Sim. As condições influenciam diretamente no resultado final, caso estejam fora do necessário (correto) obtém-se resultados negativos e fora dos padrões.

b) Os procedimentos realizados estão de acordo com o protocolo? Comente as alterações ou adaptações realizadas. Não. No procedimento dessa prática não foi feita a diluição.

c) Relacione os materiais listados neste protocolo que não foram utilizados e quais outros materiais utilizados. Será que houve alguma falha no procedimento pela falta ou substituição do material?

Nesta prática não houve utilização de outros materiais além dos listados no protocolo. Não houve falha no procedimento por falta ou substituição de material pois não houve falta ou substituição de material.

d) Quais as dificuldades encontradas na realização dessa prática?   Não houveram dificuldades.

e) Os procedimentos de biossegurança foram seguidos com rigor? Quais os possíveis riscos de acidente de trabalho que os alunos e o professor sofreram? Comente sobre as normas de biossegurança.

Sim, os alunos e o professor não passaram por possíveis riscos. As normas de biossegurança são de extrema importância para que os que realizam os procedimentos não passem por riscos ou sofram qualquer acidente.

f) Elabore 10 questões a respeito da prática ao seu professor, para melhor esclarecimento das suas dúvidas.

Não houveram dúvidas.

GRUPO: AGLAUPY RAIO-DE-LUAR VITAL FERREIRA SILVA SOUZA BRASIL;

JESSICA SOUSA; MARCOS VIEIRA; PABLO CASTRO GOMES; TUANY RODRIGUES ASSAD MACIEL; VALBER PEREIRA FERREIRA; WILANY TAVARES

Aula prática 7 – 13 de fevereiro de 2014

Teste de gravidez

1. Introdução

Níveis de hCG podem ser medidos no sangue ou na urina. Mais comumente, isto é feito com a finalidade de obter um teste de gravidez, destinado a indicar a presença ou ausência de um embrião implantado. A maioria dos testes de gravidez emprega um anticorpo monoclonal, que é específico para a subunidade do β-hCG (bHCG). Este procedimento é empregado para garantir que os testes não resultem em falsos positivos confundindo o hCG com FSH ou LH. (Os dois últimos são sempre presentes em diferentes níveis no corpo, enquanto que a presença de hCG quase sempre indica a gravidez).

O teste hCG de urina pode ser um ensaio imunoenzimático cromatográficos ou qualquer outro formato de testes, caseiros, consultório médico ou de base laboratorial. No início de gravidez, resultados mais precisos podem ser obtidos usando a primeira urina da manhã quando os níveis de hCG são mais elevados. Quando a urina é diluída (densidade específica inferior a 1.015), a concentração de hCG pode não ser representativa da sua concentração no sangue e, o teste pode ser um falso negativo.

2. Objetivo

Através da urina de uma voluntária realizar o teste de gravidez em fita.

3. Fundamento

O Teste de Gravidez é o resultado de um avançado processo biotecnológico, onde utiliza anticorpos monoclonais, policlonais e reagentes coloidais detectando a presença do hormônio hCG, mesmo em quantidade mínima, no primeiro dia de atraso menstrual.

4. Advertências e precauções

- Destinado somente para uso ”IN VITRO”, uso externo;

- Deve-se usar recipiente adequado ao teste, seguindo normas de higiene para evitar a transmissão de agentes infecciosos;

- Para melhor resultado, deve-se abrir a embalagem somente no momento de efetuar o teste;

- Manter o Teste de Gravidez em temperatura ambiente, contra calor e umidade;

- Não reutilizar o teste após seu uso. Descarte-o em recipiente adequado;

- Manter fora do alcance das crianças.

5. Estabilidade e armazenagem

O Teste de Gravidez é estável até a data de validade impressa na embalagem. Manter em temperatura ambiente (l5° - 28°C).

6. Coleta de urina

A amostra deve ser recolhida num recipiente limpo e seco, de plástico ou vidro, sem qualquer aditivo. A primeira urina do dia é a melhor por conter maior concentração de hCG, mas o teste poderá ser realizado com urina colhida, a qualquer hora do dia. As amostras podem ser refrigeradas (2 a 8⁰C) e guardadas até 72 horas antes do teste. Amostras refrigeradas devem ficar em temperatura ambiente antes de aplicar o teste.

7. Instruções de uso

Para melhor resultado ler cuidadosamente as instruções de uso antes de realizar o teste.

- Verifique a data de validade impressa no sachê de alumínio;

- Siga corretamente as instruções antes de fazer o teste;

- Colete a urina conforme as instruções;

- Abra o sachê de alumínio ao longo do picote e retire o dispositivo de Teste, coloque-o numa superfície limpa e plana, com a tarja de leitura voltada para cima até que se visualize o resultado;

- Os resultados deverão ser lidos após 5 minutos.

Importante: dentro do sachê, existe um saquinho com sílica que não deve ser utilizado no teste (serve apenas para absorver a umidade).

8. Leitura do resultado do teste

8.1 Positivo – “Grávida”

Surgindo 2 (duas) linhas em tons vermelho na área de resultado a confirmação é positiva e a mulher está grávida (Fig.2).

8.2 Negativo – “Não grávida”

Surgindo 1 (uma) linha em tom vermelho na área de resultado, a confirmação será negativa e a mulher não está grávida

8.3 Resultado inválido

Se após cinco minutos de iniciado o teste não aparecer nenhuma linha na área de resultado, significa que o resultado está inválido. Provavelmente as instruções não foram seguidas corretamente. Repita o teste no dia seguinte, usando outro Teste de Gravidez

9. Limitações do procedimento

Como com todo teste de gravidez, o diagnóstico final não deve ser feito baseado no resultado de um único teste, mas deve se basear em uma correlação dos resultados do teste com sinais clínicos típicos e sintomas.

10.Resultado

O teste deu negativo para gravidez, indicado pelo surgimento de uma linha em tom vermelho na área de resultado.

11.Questões

a) As condições necessárias para realização da prática foram observadas? Qual a influência dessas condições para a realização dos experimentos?

Sim. As condições influenciam diretamente no resultado final, caso estejam fora do necessário (correto) obtém-se resultados negativos e fora dos padrões.

b) Os procedimentos realizados estão de acordo com o protocolo? Comente as alterações ou adaptações realizadas.

Sim. Não foram realizadas quaisquer alterações.

c) Relacione os materiais listados neste protocolo que não foram utilizados e quais outros materiais utilizados. Será que houve alguma falha no procedimento pela falta ou substituição do material?

Não houve falha no procedimento, nem substituição de material.

d) Quais as dificuldades encontradas na realização dessa prática?

Não houveram dificuldades.

e) Os procedimentos de biossegurança foram seguidos com rigor? Quais os possíveis riscos de acidente de trabalho que os alunos e o professor sofreram? Comente sobre as normas de biossegurança.

Sim, os alunos e o professor não passaram por possíveis riscos. As normas de biossegurança são de extrema importância para que os que realizam os procedimentos não passem por riscos ou sofram qualquer acidente.

g) Elabore 10 questões a respeito da prática ao seu professor, para melhor esclarecimento das suas dúvidas. Não houveram dúvidas

GRUPO: AGLAUPY RAIO-DE-LUAR VITAL FERREIRA SILVA SOUZA BRASIL;

JESSICA SOUSA; MARCOS VIEIRA; PABLO CASTRO GOMES; TUANY RODRIGUES ASSAD MACIEL; VALBER PEREIRA FERREIRA; WILANY TAVARES

Aula prática 8 – 13 de fevereiro de 2014

Sorotipagem de bactérias – Sorokit para Samonella

1. Introdução: Os estreptococos de importância médica são responsáveis principalmente por infecções de trato respiratório superior (faringites e amigdalites), podendo gerar complicações como sinusite e otite, bem como propagarem-se às vias respiratórias inferiores, causando broncopneumonia e pneumonia. Algumas doenças estreptocócicas (infecção puerperal), escarlatina e erisipela.

A classificação dos estreptococos se baseia na atividade hemolítica verificada a partir de cultura (18-24h) em Agar Sangue (Oxoid Blood Agar Base CM055/CM271 ou Azide Blood Agar Base CM259) como segue:

- Streptococos Beta-hemolísticos (Grupo A, B, C, D, F e G).

- Estreptococos Alpha-Hemolísticos (Grupos D).

2. Objetivo

Realizar sorotipagem para identificação de Salmonella.

3. Fundamento

Os soros somáticos e flagelares para identificar os sorogrupos mais freqüentes e os sorotipos de maior significado clínico estão na diluição apropriada para serem utilizados em testes de aglutinação em lâmina. O Sorokit é composto pelos antisoros abaixo:

- Soros somáticos (O): permitem identificar os sorosgrupos A, B, C1, C2, D, E e o antígeno Vi.

- Soros flagelares (H): permitem identificar os antígenos flagelares a; b; c; d; i; 1, 2 e 5.

4. Princípios da identificação

Os soros somáticos visam identificar os grupos sorológicos A, B, C1, C2, D, E que representam, aproximadamente, 98% das salmonellas isoladas do homem e o antígeno Vi, que ocorre em S. Typhi e S. Paratyphi C.

Os soros H permitem caracterizar os antígenos flagelares de Salmonella, o que torna possível identificar um único sorotipo, dentro de um sorogrupo. Os antígenos H podem ocorrer em 2 fases antigenicamente distintas. Os diferentes sorotipos de Salmonella spp podem apresentar apenas 1 fase (sorotipos monofásicos) ou as 2 fases (sorotipos bifásicos). Embora bifásicos, as amostras recém isoladas apresentam, frequentemente, apenas uma das fases. Neste caso, para a identificação definitiva do sorotipo há necessidade de provocar o aparecimento da outra fase (reversão de fase), o que se consegue cultivando a Salmonella spp em um meio de cultura que contém soro os flagelos da fase que está ocorrendo.

A tabela abaixo mostra as fórmulas antigênicas dos sorotipos de Salmonella spp que o Sorokit Probac permite identificar e que são sorotipos de maior importância médica. Estes sorotipos são S. Typhi, S. Paratyphi A, S. Paratyphi C, agentes das febres tifóides e paratifóides, S. Cholerae-suis, que freqüentemente causa septicemia, e S. Typhimurium que é o sorotipo mais importante de infecção intestinal.

5. Reagentes: - Reagente da bactéria; - Solução salina; 

6. Materiais: - Placa de Petri; - Grade para colocar o tubo de ensaio; - Alça metálica; - Lâminas e lamínulas;

- Microscópio óptico.

7. Procedimento

- Primeiramente, utilizou-se uma placa de Petri inoculada com bactéria Salmonella;

- Em um tubo de ensaio foram adicionados 2 mL de solução salina. Reservou-se;

- Com a alça de alumínio, foi coletada uma alíquota da bactéria contida na placa;

- Em seguida, introduziu-se a alça com a amostra no tubo de ensaio com solução salina que estava reservada, então fez-se a “lavagem” do mesmo na solução para ocorrer a formação da suspenção de bactérias;

- Posteriormente, foram identificadas a parte fosca de 6 lâminas;

- Colocou-se 1 gota da suspensão de bactérias em cada lâmina;

- Depois, colocou-se em cada lâmina os reagentes da bactéria: A, B, C, D, FLAGELAR e SOMÁTICA;

- Homogeneizou-se com a ponta da lamínula a amostra e esperamos de 2 a 3 minutos para ocorrer a reação;

- Em seguida colocou-se a lamínula e seguimos à visualização ao microscópio.

8. Resultado

Não obtivemos resultados para os testes em Salmonella grupo A (fator 2), Salmonella grupo B (fator 4 e 5), Salmonella grupo C1 (fator 7), Salmonella grupo D (fator 9), Salmonella polivalente somática e Samonella polivalente flagelar, pois ocorreu morte das bactérias durante a realização da prática.

9. Questões

a) As condições necessárias para realização da prática foram observadas? Qual a influência dessas condições para os objetivos da experiência?

Sim, é necessário identificar os sorogrupos mais frequentes e os sorotipos de maior significado clinico que estão na diluição apropriada para serem utilizadas.

b) Os procedimentos realizados estão de acordo com o protocolo? Comente as alterações ou adaptações realizadas.

Sim. Não houveram alterações.

c) Relacione os materiais listados neste protocolo que não foram utilizados e quais outros materiais utilizados. Será que houve alguma falha no procedimento pela falta ou substituição do material?

Não foram utilizados materiais que não estivessem no protocolo, e todos os mesmos foram usados durante o processo. Não foi relatada a ocorrência de falha durante o procedimento devido falta ou substituição de material.

d) Quais as dificuldades encontradas na realização dessa prática?  Não houveram dificuldades durante o procedimento, pois tivemos a orientação do professor para a realização.

e) Os procedimentos de biossegurança foram seguidos com rigor? Quais os possíveis riscos de acidente de trabalho que os alunos e o professor sofreram? Comente sobre as normas de biossegurança.

Sim, todos os procedimentos foram seguidos com rigor. Durante a realização do procedimento não se teve risco de acidentes por alunos e professor. Biossegurança é o conjunto de ações voltadas para prevenção, proteção do trabalhador, minimização de riscos inerentes às atividades de pesquisa, produção, ensino, desenvolvimento e prestação de serviços, visando a saúde do homem e a qualidade dos resultados.

f) Não havendo um fornecedor dos antissoros, como proceder para se conseguí-los no laboratório, a partir de amostras padrões de Salmonella sorotipadas?  Pesquisar outro método a partir da amostra que esta no laboratório. É criar um antissoro para a realização do método.

g) Uma suspensão de bactéria identificadas bioquimicamente como Salmonella foi submetida a sorotipagem, sendo observado aglutinação com os soros somáticos O. Que conclusão pode-se tirar?

Que foram identificados os grupos sorológicos A, B, C1, C2, D, E.

h) Os soros H permitem caracterizar os antígenos flagelares de Salmonella, o que torna possível identificar um único sorotipo, dentro de um sorogrupo. Os antígenos H podem ocorrer em 2 fases antigenicamente distintas? Justifique.

Sim, os sorotipos Salmonella spp podem apresentar 1 fase , que são chamados de monofásicos ou apresentar 2 fases chamados de bifásicos. Mesmo constando da metodologia que pode apresentar uma segunda fase, frequentemente, apenas uma das fases se apresenta. Então, no caso de 2 fase, para a identificação definitiva do sorotipo há necessidade de provocar o aparecimento da outra fase (reversão de fase), o que se consegue cultivando a Salmonella spp em um meio de cultura que contém soro os flagelos da fase que está ocorrendo.

i) Embora bifásicos as amostras de Salmonella recém isoladas apresentam frequentemenete apenas uma das fases. Para identificação definitiva do sorotipo há necessidade de provocar a reversão de fase antigênica (aparecimento de outra fase). Como proceder para realizar o teste de forma segura?

Para realizar o teste de forma segura e necessário que se consiga cultivando a salmonella spp em um meio de cultura que contem soro os flagelos da fase que esta ocorrendo.

j) Elabore 10 questões a respeito da prática ao seu professor, para melhor esclarecimento das suas dúvidas.

Não houveram dúvidas.

GRUPO: AGLAUPY RAIO-DE-LUAR VITAL FERREIRA SILVA SOUZA BRASIL;
JESSICA SOUSA; MARCOS VIEIRA; PABLO CASTRO GOMES; TUANY RODRIGUES ASSAD MACIEL; VALBER PEREIRA FERREIRA; WILANY TAVARES

Aula prática 9 – 21 de fevereiro de 2014
Purificação de anticorpo em coluna cromatográfica de hemadsorção de anticorpos
1. Introdução
Anticorpos são proteínas que reconhecem um antígeno de forma específica e com alta afinidade. Discutiremos a seguir como estas proteínas são produzidas nos organismos pelos linfócitos e como isto pode ser manipulado para fins específicos. A descoberta dos mecanismos de produção de anticorpos é, sem sombra de dúvida, uma das grandes vitórias das ciências biológicas neste século, devido a sua complexidade, mas principalmente pelos benefícios que representa para a humanidade.
2. Objetivo
Demonstrar método de purificação de anticorpos por cromatografia de hemadsorção e obter anticorpo purificado.
3. Reagentes
- Agarose (ou Agar-ágar);
- Reagentes para tipagem sanguínea;
- Solução fisiológica;
4. Materiais
- 10 ml de sangue do tipo A+ e 10 ml de sangue do sangue do tipo B+;
- Tubos de ensaio de hemólise;
- 2 buretas de 25 ml com suporte;
- Becker de 100 ml;
- Pipetas de 10 ml;
- Microplacas de titulação;
- Centrifuga;
- Materiais para separação do plasma, lavagem de hemácia e tipagem sanguínea, que se encontram listados nas respectivas práticas 1, 2 e 3.
5. Procedimento
- Primeiramente, foi realizado o procedimento de tipagem sanguínea das amostras de sangue para confirmando o tipo sanguíneo A+ para o grupo P1-A e tipo sanguíneo B+ para o grupo P1-B;
- Da amostra de sangue do tipo B+, retirou-se 500 μL e adicionou-se 9,5ml de solução de agarose a 2%, estéril, fundida e resfriada a 45ºC;
- Em seguida foi homogeneizado e colocado em uma bureta de 25ml;
- Após o resfriamento completou-se o volume de 25 ml com solução fisiológica. O grupo P1-A repetiu a operação com amostra de sangue do tipo A+;
- Separou-se o plasma das duas amostras sanguíneas e adicionou-se solução fisiológica em cada plasma para obter uma solução de 30%;
- Realizou-se a prova cruzada da tipagem, fazendo reagir o soro diluído de um (A+ ou B+) com as hemácias (B+ ou A+) de outro e vice-versa;
- Deixou-se escorrer 15ml do soro fisiológico das buretas e colocou-se 10ml do soro diluído A+ na bureta de hemácia B+; e 10ml do soro diluído B+ na bureta A+, deixou-se escorrer, coletando as frações de amostras 1ml, até completa evasão;
- Em todas as frações do soro B+, adicionou-se 100uL de suspensão de hemácia A+ e averiguar a reação de aglutinação. O mesmo foi feito com o soro A+, adicionando 100uL da hemácia B+;
OBS.: Caso não se observe aglutinação em nenhum do tubos (exceto o controle), adicione mais 15ml de solução de NaCl a 2,7% nas buretas para desgrudar os anticorpos das hemácias e repetir a etapa anterior.
6. Resultado: Nesta prática não houve resultado, pois a bureta ficou entupida, o que impediu que o material descesse.

6. Resultado: Nesta prática não houve resultado, pois a bureta ficou entupida, o que impediu que o material descesse.

Houve reação de hemoglutinação nas Hc A+ e B+, com hemoglutinação positiva para Ac (aglutinina diluída), Ag (aglutinógeno concentrado) e soro.

7. Questões

a) As condições necessárias para realização da prática foram observadas? Qual a influência dessas condições para os objetivos da experiência?

Sim, foram observadas a estrutura do laboratório e a qualidade do estado das vidrarias e reagentes. As condições influenciam diretamente no resultado final, caso estejam fora do necessário (correto) obtém-se resultados negativos e fora dos padrões.

b) Os procedimentos realizados estão de acordo com o protocolo? Comente as alterações ou adaptações realizadas.

Sim. Os procedimentos seguiram o protocolo à risca.

c) Relacione os materiais listados neste protocolo que não foram utilizados e quais outros materiais utilizados. Será que houve alguma falha no procedimento pela falta ou substituição do material?

Não foram utilizados materiais que não estivessem no protocolo, e todos foram usados durante o processo. Não foi relatada a ocorrência de falha durante o procedimento devido falta ou substituição de material.

d) Quais as dificuldades encontradas na realização dessa prática?

A dificuldade encontrada foi para que descesse o material da bureta, devido o ágar ter entupido a mesma.

e) Os procedimentos de biossegurança foram seguidos com rigor? Quais os possíveis riscos de acidente de trabalho que os alunos e o professor sofreram? Comente sobre as normas de biossegurança.

Sim, os alunos e o professor não passaram por possíveis riscos. As normas de biossegurança são de extrema importância para que os que realizam os procedimentos não passem por riscos ou sofram qualquer acidente.

f) Caso sejam observados aglutinações em todas as frações do soro, que conclusão se pode tirar?

Que há presença de anticorpo.

g) Caso sejam observados ausência de aglutinações em todas as frações do soro, que conclusão se pode tirar? Que não há anticorpo ou que houve erro no procedimento. Deve-se adicionar mais 15 mL da solução de NaCl a 2,7% nas buretas para os anticorpos das Hc desgrudem e repetir o procedimento.

h) Caso sejam observadas aglutinações somente nas frações do soro eluído como soro fisiológico, que conclusão se pode tirar?  Não foram observadas aglutinações.

i) Caso sejam observados aglutinações somente nas frações do soro eluído como sol. NaCl a 2,7%, que conclusão se pode tirar? Que os anticorpos interagiram com NacL.

GRUPO: AGLAUPY RAIO-DE-LUAR VITAL FERREIRA SILVA SOUZA BRASIL;
JESSICA SOUSA; MARCOS VIEIRA; PABLO CASTRO GOMES; TUANY RODRIGUES ASSAD MACIEL; VALBER PEREIRA FERREIRA; WILANY TAVARES

Aula prática 10 – 28 de fevereiro de 2014

Imunoprecipitação em gel

1. Introdução

A imunoprecipitação em gel nada é mais do que uma interação de Ag e Ac no interior de um suporte neutro, constituído por ágar ou ágarose.

Esta técnica combina difusão com precipitação. A difusão dos componentes da reação pode ser unidirecional ou radical, passiva ou impulsionada por um campo elétrico.

Os componentes da reação são colocados em regiões opostas, dentro de orifícios previamente preparados, em placa ou lâmina de ágarose, deforma que eles possam se difundir livremente um em direção ao outro, formando linha de precipitação, facilmente visível, quando atingem uma relação ótima de Ag Ac (ponto de equivalência).

2. Objetivo

Realizar imunoprecipitação em gel e averiguar uma reação de precipitação.

3. Princípio

Tanto o antissoro quanto o antígeno solúvel se difundem no ágar e na zona de equilibrio das concentrações (Ag x Ac) forma um precipitado que é visto em forma de uma linha. A precipitação em gel de ágar é amplamente utilizada em imunologia de diagnóstico. Ela é particularmente útil na quantificação de concentrações de imunoglobulinas e na imunoeletroforese. Na imunoquantificação, o ágar é impregnado por antissoro e o material a ser testado é colocado em orifícios.

Os diâmetros dos anéis concêntricos de precipitação que se formam são diretamente proporcionais à concentração do antígeno em questão. Estas técnicas são úteis na quantificação de imunoglobulinas em muitos estudos epidemiológicos, como as doenças imunoproliferativas e as deficiências imunológicas.

4. Reagentes: - Ágar fundido; - Antisoro e antígeno; 

5. Materiais: - Lâmina de microscópio; - Pipeta com a ponta da ponteira cortada para perfurar os orifícios.

6. Procedimento

- Primeiramente, recobriu-se uma lâmina de microscópio com ágarose 0,1% (em água) e deixou-o secar na estufa;

- Depositou-se nessa lâmina cerca de 5ml de agarose a 1% preparado em salina (contendo mertiolato a 0,01% ou ázida sódica a 0,1%) até obter camada de 3mm de espessura;

- Esperou a solidificação;

- Cortou-se a ponta da ponteira para facilitar a aspiração do ágar e formaram-se dois orifícios;

- Em um tubo de ensaio foi preparada hemácia lisada, com 10 μL de Hc e adicionados 25 μL de água destilada;

- Em seguida, colocou-se 10 μL da Hc lisada e 1 gota dos regentes Ac e Ag (anti-A).

7. Resultado: Não houve reação.

8. Questões

a) As condições necessárias para realização da prática foram observadas? Qual a influência dessas condições para o imunodiagnóstico?

Sim. As condições influenciam diretamente no resultado final, caso estejam fora do necessário (correto) obtém-se resultados negativos e fora dos padrões.

Fig. 12: Lâmina coberta com ágar e a reagentes no orifício.

b) Os procedimentos realizados estão de acordo com o protocolo? Comente as alterações ou adaptações realizadas.

Não. Fazendo uma correlação com o protocolo disponibilizado no blog do Prof. Luis Carlos Carvalho, foram feitas algumas alterações como: na coleta não foi utilizado o vácuo e sim da seringa, para a separação do soro ou plasma as amostras não foram colocadas no banho-maria e a tampa do tubo não foi vedada com fita crepe, pois a amostra seria utilizada para a próxima prática.

c) Relacione os materiais listados neste protocolo que não foram utilizados e quais outros materiais utilizados. Será que houve alguma falha no procedimento pela falta ou substituição do material?

Não foram utilizados o tubo à vácuo, o banho-maria e a fita crepe; não há outros materiais a serem usados. Suponhamos que a utilização da seringa ao invés do vácuo para coleta resultou em pouca amostra se compararmos as duas técnicas. Quanto à não utilização do banho-maria na fase de separação do soro ou plasma e não ter vedado a tampa do tubo com fita crepe não interferiu no resultado.

d) Quais as dificuldades encontradas na realização dessa prática?

Não houveram dificuldades.

e) Os procedimentos de biossegurança foram seguidos com rigor? Quais os possíveis riscos de acidente de trabalho que os alunos e o professor sofreram? Comente sobre as normas de biossegurança.

Sim. Devido termos seguido os procedimentos de biossegurança com rigor, os alunos e o professor não sofreram quaisquer riscos de acidente de trabalho. As normas de biossegurança são:

- Utilização dos EPI’s;

- Não manusear materiais biológicos, reagentes e materiais perfurocortantes próximo aos olhos;

- Seguir os procedimentos com rigor, a fim de prevenir possíveis riscos.

f) Quais as orientações ao paciente que se deve dar antes e após a coleta de sangue?

Antes deve-se verificar se o paciente está em jejum, se faz uso de algum medicamento, ao garrotear o braço pedir que ele feche a mão e após a punção pedir que ele a abra. Após a coleta deve-se verificar se o paciente está bem, pedir para o mesmo segurar o algodão sem apertar e esfregar, não dobrar o braço, aguardar alguns instantes para se levantar e disponibilizar um lanche.

g) Elabore 10 questões a respeito da prática ao seu professor, para melhor esclarecimento das suas dúvidas.

Não houveram dúvidas.