RELATÓRIOS DE PRÁTICAS: IMUNOLOGIA CLÍNICA
ANA LIVIA DE MORAIS MACEDO
BRUNA CAROLINA BEZERRA LIMA
CAMILA MACEDO SOARES
ERISMAR DE JESUS SOUSA
HUGO LEONARDO RODRIGUES LIMA
IALAINE DE MORAIS SOUZA
LUANA DA SILVA RIBEIRO
MARIANNA DA SILVA PEREIRA
PATRICIA DOS REIS DA SILVA
POLYANA BRUNA DE CASTRO SILVA FREITAS
PRISCILA BRASIL
RODOLFO ANDRADE LEDA
RAILANE FERNANDES
SUELEN ALVES M. DE OLIVEIRA
RELATÓRIOS DE PRÁTICAS: IMUNOLOGIA CLÍNICA
Trabalho
apresentando a faculdade De Imperatriz-FACIMP na disciplina De Imunologia como
requisito Parcial de notas.
Orientador: Profº Luis Carlos
Carvalho
IMPERATRIZ – MA
2015.
PROCESSAMENTO DE AMOSTRA – SEPARAÇÃO DE PLASMA
1.
Introdução
O plasma
sanguíneo é componente líquido do sangue, no qual as células sanguíneas
encontram-se suspensas. Apresenta coloração amarelada e corresponde a
aproximadamente 55% do volume sanguíneo total. Uma das técnicas mais simples
para separar a parte líquida do sangue (plasma) da parte sólida, é através da
centrifugação. O soro, obtido por meio da coagulação sanguínea, corresponde ao
plasma sanguíneo sem os fatores de coagulação, como, por exemplo, a fibrina.
Esta porção do sangue tipicamente é utilizada em testes sorológicos que visam
pesquisar a presença de determinados anticorpos.
2. Objetivo
Processar a
amostra de sangue para a separação do plasma.
3.
Materiais
EPI’s;
Seringa de 3 mL com agulha descartável; Garrote; Tubos de ensaio; Álcool 70%;
Algodão; Centrífuga; Pinça; Grade.
4.
Procedimentos
4.1 Coleta
de sangue
-
Primeiramente observou-se se o paciente estava em condições de mobilidade
normais, o mesmo sentou-se confortavelmente em cadeira com descanso para o
braço, deixando-o acessível para a coleta;
- Antes de
iniciar a coleta, lavou-se as mãos, calçou-se luvas, identificou-se os tubos,
encaixou-se a agulha na seringa, inspecionou-se a ponta da agulha (não deve
estava rombuda ou torta) e moveu-se o êmbolo da seringa;
-
Colocou-se o torniquete (garrote) para que as veias ficassem mais salientes, em
seguida inspecionaram-se as veias cuidadosamente e verificou-se a mais adequada
para a punção;
- Foi feita
a assepsia do local com algodão embebido em álcool 70%, em seguida,
puncionou-se a veia e coletou-se o sangue;
- A pressão
do torniquete não deve ser mantida mais que 60 segundos, porque produz aumentos
na concentração de células sanguíneas;
-
Colocou-se o sangue, cuidadosamente nos tubos próprios, deixando escorrer
suavemente pela parede interna do tubo;
4.2 Preparo
da amostra
4.2.1
Separação do soro ou plasma
-
Calçaram-se as luvas;
- Foi
aberta a centrífuga, colocaram-se os tubos com o sangue nas “caçapas”, tomando
o cuidado de equilibrá-los;
- Fechou-se
a tampa da centrífuga, marcou-se 3000 a 4000 RPM e foi ligada por 5 minutos;
- Não se
deve abrir a tampa da centrífuga antes de parar totalmente de rodar e nem
tentar parar com a mão ou instrumentos (recomenda-se não abrir a centrífuga
imediatamente após parar, devido formação de aerossóis que podem ser
infectantes, por isto, deve-se esperar alguns minutos para que as partículas
sedimentem);
- Os tubos
foram retirados das caçapas com auxílio de uma pinça e colocou-os na grade;
- Verificou-se
o aspecto da amostra. O soro ou plasma estava livre de resíduos de hemácias;
- Caso o
soro estivesse fortemente hemolisado ou lipêmico, uma nova coleta deveria ser
providenciada;
4.2.2
Identificação da amostra
- A amostra
estava identificada com etiqueta autocolante, em letra legível, contendo: nome
do paciente, idade, sexo, tipo de exame, local de procedência.
5.
Resultado
Na prática
obteve-se a separação do plasma e o soro a partir da centrifugação do sangue, o
mesmo foi utilizado para a prática posterior.
HAI
- CHAGAS
Método
hemaglutinação indireta (HAI)
Finalidade
Quite para determinação qualitativa e semi-quantitativa de anticorpos
anti-trypanossoma cruzi no soro por aglutinação indireta.
Somente para uso diagnóstico in vitro.
Reagentes
1. Suspenção se hemácias:
Contem suspensão de hemácia de ave sensibilizada com
componentes antigênicos do trypanossoma cruzi em solução tampão salina
formalizada. Potencialmente infectante. Pronta para uso.
2. Diluente :
Contem tampão fosfato salina
3. Mercaptoetano :
Solução concentrada de 2-mercaptoetanol. Pronta para
uso. Conservar ao abrigo da luz.
P- controle positivo- soro de carneiro anti-T.cruzi
em tampão fosfato salino e azida sódica 15,4 mmol/L. pronto para uso.
N- controle negativo- soro humano em tampão fosfato
salino em azida sódica 15,4 mmol/L. pronto para uso.
Materiais
utilizados
Tubo de ensaio; pipeta; ponteiras; placa de microtitulação .
Amostra: Soro
Procedimento
1. colocar a placa de microtitulação sobre um pano úmido para neutralizar as
forças eletrostática;
2. Usar uma cavidade da placa por amostra, incluindo sempre os controles
positivos e negativo;
3. Diluir em tubo de ensaio (diluição 1/32) : 10 microlitos L do soro + 310 microlitos
L de diluente de uso;
4. Pipetar 50 microlitos L de controle positivo (p), controle negativo (n) e
da diluição 1/32 de cada amostra nas respectivas cavidades da placa;
5. Adicionar 25 microlitos L da suspensão de hemácia, homogeneizar em cada
cavidade ;
6. Deixar a placa em pouso por 1 a 2 horas à temperatura ambiente em local
libre de librações;
7. Fazer a leitura.
Resultados
SEROLATEX
AEO
Introdução
Os Streptococcus
pyogenes (estreptococo b-hemolítico do grupo A) são importantes bactérias patogênicas
gram-positivas, que colonizam principalmente a orofaringe e a pele, sendo
responsáveis por processos infecciosos supurativos e não supurativos. A febre
reumática (FR) e a glomerulonefrite pós-estreptocócica (GN) são sequelas não
supurativas da infecção causada por S. pyogenes.
A Estreptolisina O é
uma exoenzima imunogênica tóxica produzida pelos estreptococos ß-hemolíticos do
grupo A. A determinação da resposta dos anticorpos frente à presença de
Estreptolisina O é um procedimento rotineiro para o diagnóstico e tratamento da
febre reumática, glomerulonefrite aguda, escarlatina, amigdalite, erisipela,
sépsis puerperal e outras infecções estreptocócicas do grupo A. O exame
consiste basicamente em partículas de látex que são revestidas com
Estreptolisina O, estáveis e puras que desenvolvem uma aglutinação visível
quando são misturadas com um soro contendo níveis elevados de anticorpos
Antiestreptolisina.
Objetivo
A determinação qualitativa e semi-quantitativa
da Antiestreptolisina O em amostras de sangue é útil na abordagem diagnóstica e
classificação das artropatias.
Materiais
1.
Pipetas
para medir amostras e reagentes.
2.
Cronômetro.
3.
Lâmina
e bastões misturadores.
4.
Amostra
(soro sem hemólise).
Procedimento
Método qualitativo
1.
Não
é necessário que os reagentes atinjam a temperatura ambiente para usá-los.
2.
Em
uma área da lâmina colocar 0,04 mL da amostra e uma gota de cada controle em
outras áreas.
3.
Colocar
1 gota (0,04 mL) do Látex AEO (previamente homogeneizado) ao lado da amostra e
dos controles. Misturar em forma de círculo com o auxílio do bastão.
4.
Inclinar
a lâmina para frente e para trás, com movimentos oscilatórios em vários planos
durante 2 minutos e, imediatamente, verificar a presença ou não de aglutinação
macroscópica, comparando o resultado da amostra com os padrões obtidos com os
controles.
5.
Proceder
à interpretação da reação:
Negativo: Suspensão
homogênea semelhante ao padrão obtido com o controle negativo.
Positivo: Aglutinação
macroscópica que varia desde a formação de grumos finos até grumos grosseiros,
caracterizando uma concentração maior que 200 UI/mL. As características da
aglutinação não devem ser usadas como indicadoras da concentração de AEO na
amostra. Para isto deve-se diluir a amostra utilizando o método
semi-quantitativo.
Significado
clinico
A antiestreptolisina O é um anticorpo
decorrente da interação imunológica entre o organismo e produtos extra
celulares do Estreptococo. A resposta imunológica depende da idade do paciente,
localização geográfica e da frequência das infecções estreptocócicas. Como as
infecções estreptocócicas são comuns, a AEO está presente em baixos títulos na
maioria das pessoas. Títulos elevados e crescentes, atingindo um nível máximo
em 4-6 semanas após a infecção, sugerem infecção estreptocócica recente.
Portanto, as determinações seriadas que documentam a elevação da AEO, são
evidências mais significativas de infecção recente que o resultado de um teste
isolado.
Quando um paciente tem sinais que
sugerem febre reumática, é muito importante verificar a ocorrência de uma
infecção recente. O teste é um importante marcador para diagnóstico diferencial
entre febre reumática e artrite reumatóide quando o quadro clínico não é
decisivo, visto que a AEO não se eleva na artrite reumatóide.
Em pacientes com suspeita de
glomerulonefrite pós estreptocócica, a evidência de infecção recente pode ser
encontrada nos títulos em elevação da AEO. Também nas infecções estreptocócicas
da faringe observam-se títulos de AEO maiores que 200 UI/mL.
A maioria das crianças com infecção
estreptocócica da pele não desenvolvem títulos significativos da AEO.
É importante enfatizar que a AEO é um
marcador de infecção estreptocócica e não deve ser utilizada como uma prova de
atividade reumática. Como a AEO é um anticorpo, sua elevação se processa no
mínimo após 7 dias do inicio do processo infeccioso, não sendo um marcador de
processo inflamatório com elevação tão precoce quanto a Proteína-C Reativa.
Resultado
Negativo (não houve aglutinação na
amostra do soro do paciente).
TIPAGEM
SANGUINEA
INTRODUÇÃO
A Tipagem Sanguínea é um teste realizado para estabelecer
qual tipo sanguíneo e Fator Rh (positivo ou negativo) uma pessoa possui. É
muito importante saber o tipo de sangue antes de se fazer uma transfusão
sanguínea, pois pode haver incompatibilidade entre o doador e o receptor e, em
casos de emergência, pode haver necessidade desta transfusão.
Pessoas
dos grupos A, B e O produzem naturalmente anticorpos que causam reações graves se
receberem por transfusão sangue incompatível. Se uma pessoa Rh-negativa receber
sangue (for transfundida) Rh-positivo, ela começa a produzir anticorpos
anti-Rh. Estes causarão problemas se essa pessoa voltar a receber outra
transfusão de sangue Rh-positivo.
A tipagem do grupo Rh é importante durante a gravidez, porque pode haver
incompatibilidade entre a mãe e o feto. Se a mãe for Rh-negativa e o pai for
Rh-positivo, o feto pode ser Rh-positivo e a mãe pode desenvolver anticorpos
que atravessam a placenta e destroem as hemácias do feto.
OBJETIVO
Determinar o
grupo sanguíneo de uma pessoa e que tipos de sangue ou derivados de sangue ela
pode receber.
MATERIAIS
·
Tubo de ensaio;
·
Pipeta;
·
Ponteira;
·
Grade;
PROCEDIMENTO DO
EXAME
·
Em um tubo de ensaio colocar 500µl de sangue
total e 4,5 ml de solução salina;
·
Centrifugar a 1500 RPM por 2 minutos;
·
Desprezar o sobrenadante;
·
Repetir o mesmo procedimento por 3 vezes;
·
Obter uma suspensão à 5%
·
Retirar 100 µl da e adicionar no tubo A, B e Rh
·
Adicionar no tubo A 2 gotas de anti-A
·
No tubo B, 2 gotas de anti-B
·
E no Rh, 2 gotas de anti-Rh.
·
Centrifugar por 2 minutos
·
Observar se houve aglutinação ou não.
RESULTADO
Tabela 1: Grupo
sanguíneo
GRUPO SANGUÍNEO E
FATOR RH
|
PODE RECEBER SANGUE
|
A positivo
|
A positivo, A negativo, O positivo, O negativo
|
A negativo
|
A negativo, O negativo
|
B positivo
|
B positivo, B negativo, O positivo, O negativo
|
B negativo
|
B negativo, O negativo
|
AB positivo
|
AB positivo, AB negativo, A positivo, A negativo, B positivo, B
negativo, O positivo, O negativo
|
AB negativo
|
AB negativo, A negativo, B negativo, O negativo
|
O positivo
|
O positivo, O negativo
|
O negativo
|
O negativo
|
O
paciente obteve o grupo sanguíneo tipo O e o Rh negativo (-)
LAVAGEM DE HEMÁCIAS
O
procedimento de lavagem de hemácias requer pelo menos três lavagens sucessivas
com soro fisiológico, deixando uma taxa residual de plasma de aproximadamente
0,8%. Tem também a finalidade de remover, ao máximo possível, as proteínas
plasmáticas, os leucócitos e as plaquetas.
PROCEDIMENTO
· Adicionar
soro fisiológico no tubo contendo as hemácias;
· Homogeneizar
lentamente até que as hemácias fiquem bem misturadas ao soro, tendo o cuidado
de não provocar hemólise.
· Centrifugar
a 3000 Rpm, a 10°C durante dez minutos;
· Após
a centrifugação, decantar o sobrenadante para um frasco. Este primeiro
sobrenadante apresentará um aspecto hemolisado.
· Repetir
a operação, até que o sobrenadante apresente um aspecto límpido. Normalmente
tornam-se necessárias 3 lavagens.
· Na
última lavagem deixar um pouco soro fisiológico no tubo que contém as hemácias
lavadas.
A
lavagem do concentrado de hemácias remove quase todo o plasma.
Indicações:
· Hemoglobinúria
paroxística noturna;
· Reações
transfusionais do tipo alérgico ligadas à presença de anti-corpos anti-IgA;
· Insuficiência
renal grave.
PREPARO DA SUSPENSÃO DE HEMÁCIAS A
5%
PROCEDIMENTO
-
Em um tubo cônico colocar 1 mL de sangue total homogeneizado colhido com
anticoagulante + 9mL de soro fisiológico (NaCl 0,85%).
-
Centrifugar a 2.500 rpm durante 2 minutos.
-
Desprezar o sobrenadante.
-
Repetir este procedimento mais 2 vezes.
-
A partir do sedimento de hemácias lavadas, preparar uma suspensão a 5% (50µL do
sedimento de hemácias + 950µL de soro fisiológico).
INTERPRETAÇÃO
Grupo
Sanguíneo
|
Anti-A
|
Anti-B
|
AB
|
+
|
+
|
A
|
+
|
-
|
B
|
-
|
+
|
O
|
-
|
-
|
- Sinal + indica presença de aglutinação
- Sinal – indica ausência de
aglutinação
PROVA
CRUZADA
FUNDAMENTO
Consiste
na pesquisa de incompatibilidade entre receptor e doador, mediante a mistura
dos dois sangues. Se ocorrer reação antígeno-anticorpo (incompatibilidade),
esta poderá ser visualizada através da aglutinação ou hemólise.
PROCEDIMENTO
·
Centrifugar as amostras de sangue do
doador e receptor.
·
Tomar 4 tubos de hemólise e numerá-los
de 1 a 4.
·
Nos tubos 1 e 3 colocar 2 gotas do
plasma do receptor e uma gota de hemácias do doador.
·
Nos tubos 2 e 4 colocar 2 gotas de
plasma do doador e uma gota de hemácias do receptor.
·
Colocar os tubos no banho-maria por 5
minutos.
·
Centrifugar.
·
Realizar a leitura.
INTERPRETAÇÃO
Não
poderá ocorrer hemólise ou aglutinação em nenhum dos tubos. O teste de Coombs
também deverá apresentar resultado negativo. Caso contrário, a transfusão não
poderá ser realizada.
GRUPO
|
AGLUTINOGENIO
|
AGLUTININA
|
A
|
A
|
Anti-B
|
B
|
B
|
Anti-A
|
AB
|
A e B
|
---
|
O
|
---
|
Anti-A e Anti-B
|
TOXOPLASMOSE
INTRODUÇÃO
A toxoplasmose é uma infecção
causada por um protozoário, o toxoplasma gondi. Ele pode parasitar todas as
células nucleadas, as manifestações clínicas podem ser muito variáveis, tais
como: coriorretinites, miocardites, pericardites, pneumonias, miosites, meningo
encefalites, hepatites, ocorrendo isoladamente ou combinadas, certas vezes
difusas, vistas em pacientes portadores de imunodeficiências ou recebendo
terapêutica imunossupressora.
AMOSTRA
Usar soros frescos ou conservados
a -20ºC (máximo de 4 a 6 semanas) de pacientes em jejum. As amostras devem
estar a temperatura ambiente antes do uso e não necessitam de qualquer
tratamento prévio. Não usar soro hemolisado, contaminado ou lipêmico. Evitar o
congelamento e descongelamento repetidos das amostras. Os soros envelhecidos
tendem a se gelificar ao contato com o 2-Mercaptoetanol.
MATERIAIS
• Tubos de ensaio
• Pipetas sorológicas
• Estante de tubos e rack
• Recipiente para descarte de
material
PROCEDIMENTO
Objetivo: para triagem e
eliminação dos soros não reagentes.
1. Colocar a placa sobre um pano
úmido para neutralizar as forças eletrostáticas.
2. Usar 1 cavidade da placa por
amostra, incluindo sempre os controles positivo e negativo, prontos para uso.
ATENÇÃO:
Não
diluir os soros controles. Estes são fornecidos prontos para uso.
3. Utilizar diluição do soro 1/32
com a solução diluente (2). Recomenda-se diluir em um tubo de ensaio 10μl da
amostra + 310μl da solução diluente.
4. Pipetar 25μl do soro controle
positivo, negativo e da diluição 1/32 de cada amostra nas respectivas cavidades
da placa. Sugere-se: A1 controle positivo, A2 controle negativo eA3, A4, A5...
soros a serem testados.
5. Adicionar 25μl da suspensão
homogênea de hemácias (1) em cada cavidade.
6. Agitar a placa por vibração
mecânica (agitador de placa) ou batendo com os dedos nas bordas da placa por 3
a 4 minutos.
7. Deixar em repouso por 1 a 2
horas em temperatura ambiente, em local livre de vibrações (IMPORTANTE).
8. Fazer leitura (ver
procedimento semi quantitativo).
INTERPRETAÇÃO
Soros que dão reação negativa são
informados como NÃO REAGENTES significam ausência de infecção atual ou
pregressa para toxoplasmose.
Nos casos em que ocorre reação
negativa, mas com suspeita clínica de toxoplasmose, deve-se repetir o teste
após alguns dias, pois pode tratar-se de período pré-sorológico.
Todos os soros que apresentam
reação positiva deverão ser testados quantitativamente para determinação da
fase da doença.
TESTE
SEMI QUALITATIVO
1. Partir de uma diluição do soro
de 1/32 conforme item 3 do teste qualitativo.
2. Pipetar 25μl da solução
diluente (2) a partir da segunda cavidade da placa até a diluição que se
pretende estudar. Ex.: Se pretende diluir o soro até 1/512, pipetar 25μl do
diluente nas cavidadesA2, A3, A4 eA5. Não pipetar naA1.
3. Transferir 25μl da diluição do
soro 1/32 para a primeira (A1) e segunda (A2) cavidades. Homogeneizar bem o
soro com diluente na segunda cavidade diluição 1/64) e transferir 25μl para a
terceira cavidade (diluição 1/128) e assim sucessivamente, desprezando 25μl no
final.
4. Pipetar 25μl da suspensão
homogênea de hemácias (1) em todas as cavidades.
5. Agitar a placa por vibração
mecânica (agitador de placas) ou batendo com os dedos nas bordas da placa por 3
a 4 minutos.
6. Deixar em repouso por 1 a 2
horas na temperatura ambiente, em local livre de vibrações (IMPORTANTE).
7. Fazer leitura.
Reação
negativa:
Quando as hemácias se depositam no fundo da cavidade
Formando um botão.
Reação
positiva:
Quando as hemácias se depositam no fundo da cavidade como um tapete, às vezes
com bordas irregulares.
Título
da amostra:
Maior diluição que mostra uma reação positiva. O ponto final é quando o tapete
de hemácias cobre 50% do fundo da cavidade.
Determinação
de infecção recente (IgM) ou presença de anticorpos inespecíficos: O uso do
2-Mercaptoetanol possibilita a diferenciação, nos testes de hemaglutinação, de
infecção recente ou presença de anticorpos inespecíficos.
PROCEDIMENTO
1. Realizar o teste do soro
tratado com 2-Mercaptoetanol paralelo ao Teste
Semi Quantitativo.
2. Tratamento do soro: pipetar em
um tubo de ensaio 10 l de soro inativado ou não, 310 l da solução de
2-Mercaptoetanol diluído (corresponde a uma diluição 1:32). Incubar a 37ºC por
1 hora.
INTERPRETAÇÃO:
Teste Negativo: paciente não
imune ou em fase pré-sorológica. Se houver suspeita clínica, repetir após 1 ou
2 semanas.
Títulos do soro tratado e não
tratado com 2-ME semelhantes (menos de 2 diluições): Provável toxoplasmose pregressa.
ATENÇÃO: este resultado
não exclui infecção recente (presença de IgM) e, portanto, técnicas mais
sensíveis como a imunofluorescência ou ELISA para detectar IgM devem ser
usadas.
Queda de 2 ou mais títulos do
soro tratado em relação ao não tratado: provável infecção recente (presença de
IgM).
ATENÇÃO: se os títulos
forem baixos e o tratado negativar, deve-se afastar a presença de anticorpos
inespecíficos, repetindo-se o teste após 1 a 2 semanas e observando se ocorre
aumento do título.