IMUNOLOGIA CLINICA

RELATÓRIOS DE PRÁTICAS: IMUNOLOGIA CLÍNICA

ANA LIVIA DE MORAIS MACEDO

BRUNA CAROLINA BEZERRA LIMA

CAMILA MACEDO SOARES

ERISMAR DE JESUS SOUSA

HUGO LEONARDO RODRIGUES LIMA

IALAINE DE MORAIS SOUZA

LUANA DA SILVA RIBEIRO

MARIANNA DA SILVA PEREIRA

PATRICIA DOS REIS DA SILVA

POLYANA BRUNA DE CASTRO SILVA FREITAS

PRISCILA BRASIL

RODOLFO ANDRADE LEDA

RAILANE FERNANDES

SUELEN ALVES M. DE OLIVEIRA

RELATÓRIOS DE PRÁTICAS: IMUNOLOGIA CLÍNICA

Trabalho apresentando a faculdade De Imperatriz-FACIMP na disciplina De Imunologia como requisito Parcial de notas.

Orientador: Profº Luis Carlos Carvalho

IMPERATRIZ – MA

2015.

PROCESSAMENTO DE AMOSTRA – SEPARAÇÃO DE PLASMA

1. Introdução

O plasma sanguíneo é componente líquido do sangue, no qual as células sanguíneas encontram-se suspensas. Apresenta coloração amarelada e corresponde a aproximadamente 55% do volume sanguíneo total. Uma das técnicas mais simples para separar a parte líquida do sangue (plasma) da parte sólida, é através da centrifugação. O soro, obtido por meio da coagulação sanguínea, corresponde ao plasma sanguíneo sem os fatores de coagulação, como, por exemplo, a fibrina. Esta porção do sangue tipicamente é utilizada em testes sorológicos que visam pesquisar a presença de determinados anticorpos.

2. Objetivo

Processar a amostra de sangue para a separação do plasma.

3. Materiais

EPI’s; Seringa de 3 mL com agulha descartável; Garrote; Tubos de ensaio; Álcool 70%; Algodão; Centrífuga; Pinça; Grade.

4. Procedimentos

4.1 Coleta de sangue

- Primeiramente observou-se se o paciente estava em condições de mobilidade normais, o mesmo sentou-se confortavelmente em cadeira com descanso para o braço, deixando-o acessível para a coleta;

- Antes de iniciar a coleta, lavou-se as mãos, calçou-se luvas, identificou-se os tubos, encaixou-se a agulha na seringa, inspecionou-se a ponta da agulha (não deve estava rombuda ou torta) e moveu-se o êmbolo da seringa;

- Colocou-se o torniquete (garrote) para que as veias ficassem mais salientes, em seguida inspecionaram-se as veias cuidadosamente e verificou-se a mais adequada para a punção;

- Foi feita a assepsia do local com algodão embebido em álcool 70%, em seguida, puncionou-se a veia e coletou-se o sangue;

- A pressão do torniquete não deve ser mantida mais que 60 segundos, porque produz aumentos na concentração de células sanguíneas;

- Colocou-se o sangue, cuidadosamente nos tubos próprios, deixando escorrer suavemente pela parede interna do tubo;

4.2 Preparo da amostra

4.2.1 Separação do soro ou plasma

- Calçaram-se as luvas;

- Foi aberta a centrífuga, colocaram-se os tubos com o sangue nas “caçapas”, tomando o cuidado de equilibrá-los;

- Fechou-se a tampa da centrífuga, marcou-se 3000 a 4000 RPM e foi ligada por 5 minutos;

- Não se deve abrir a tampa da centrífuga antes de parar totalmente de rodar e nem tentar parar com a mão ou instrumentos (recomenda-se não abrir a centrífuga imediatamente após parar, devido formação de aerossóis que podem ser infectantes, por isto, deve-se esperar alguns minutos para que as partículas sedimentem);

- Os tubos foram retirados das caçapas com auxílio de uma pinça e colocou-os na grade;

- Verificou-se o aspecto da amostra. O soro ou plasma estava livre de resíduos de hemácias;

- Caso o soro estivesse fortemente hemolisado ou lipêmico, uma nova coleta deveria ser providenciada;

4.2.2 Identificação da amostra

- A amostra estava identificada com etiqueta autocolante, em letra legível, contendo: nome do paciente, idade, sexo, tipo de exame, local de procedência.

5. Resultado

Na prática obteve-se a separação do plasma e o soro a partir da centrifugação do sangue, o mesmo foi utilizado para a prática posterior.

HAI - CHAGAS

Método

hemaglutinação indireta (HAI)

Finalidade

Quite para determinação qualitativa e semi-quantitativa de anticorpos anti-trypanossoma cruzi no soro por aglutinação indireta.

Somente para uso diagnóstico in vitro.

Reagentes

1. Suspenção se hemácias:

Contem suspensão de hemácia de ave sensibilizada com componentes antigênicos do trypanossoma cruzi em solução tampão salina formalizada. Potencialmente infectante. Pronta para uso.

2. Diluente :

Contem tampão fosfato salina

3. Mercaptoetano :

Solução concentrada de 2-mercaptoetanol. Pronta para uso. Conservar ao abrigo da luz.

P- controle positivo- soro de carneiro anti-T.cruzi em tampão fosfato salino e azida sódica 15,4 mmol/L. pronto para uso.

N- controle negativo- soro humano em tampão fosfato salino em azida sódica 15,4 mmol/L. pronto para uso.

Materiais utilizados

Tubo de ensaio; pipeta; ponteiras; placa de microtitulação .

Amostra: Soro

Procedimento

1. colocar a placa de microtitulação sobre um pano úmido para neutralizar as forças eletrostática;

2. Usar uma cavidade da placa por amostra, incluindo sempre os controles positivos e negativo;

3. Diluir em tubo de ensaio (diluição 1/32) : 10 microlitos L do soro + 310 microlitos L de diluente de uso;

4. Pipetar 50 microlitos L de controle positivo (p), controle negativo (n) e da diluição 1/32 de cada amostra nas respectivas cavidades da placa;

5. Adicionar 25 microlitos L da suspensão de hemácia, homogeneizar em cada cavidade ;

6. Deixar a placa em pouso por 1 a 2 horas à temperatura ambiente em local libre de librações;

7. Fazer a leitura.

Resultados

SEROLATEX AEO

Introdução

Os Streptococcus pyogenes (estreptococo b-hemolítico do grupo A) são importantes bactérias patogênicas gram-positivas, que colonizam principalmente a orofaringe e a pele, sendo responsáveis por processos infecciosos supurativos e não supurativos. A febre reumática (FR) e a glomerulonefrite pós-estreptocócica (GN) são sequelas não supurativas da infecção causada por S. pyogenes.

A Estreptolisina O é uma exoenzima imunogênica tóxica produzida pelos estreptococos ß-hemolíticos do grupo A. A determinação da resposta dos anticorpos frente à presença de Estreptolisina O é um procedimento rotineiro para o diagnóstico e tratamento da febre reumática, glomerulonefrite aguda, escarlatina, amigdalite, erisipela, sépsis puerperal e outras infecções estreptocócicas do grupo A. O exame consiste basicamente em partículas de látex que são revestidas com Estreptolisina O, estáveis e puras que desenvolvem uma aglutinação visível quando são misturadas com um soro contendo níveis elevados de anticorpos Antiestreptolisina.

Objetivo

A determinação qualitativa e semi-quantitativa da Antiestreptolisina O em amostras de sangue é útil na abordagem diagnóstica e classificação das artropatias.

Materiais

1. Pipetas para medir amostras e reagentes.

2. Cronômetro.

3. Lâmina e bastões misturadores.

4. Amostra (soro sem hemólise).

Procedimento

Método qualitativo

1. Não é necessário que os reagentes atinjam a temperatura ambiente para usá-los.

2. Em uma área da lâmina colocar 0,04 mL da amostra e uma gota de cada controle em outras áreas.

3. Colocar 1 gota (0,04 mL) do Látex AEO (previamente homogeneizado) ao lado da amostra e dos controles. Misturar em forma de círculo com o auxílio do bastão.

4. Inclinar a lâmina para frente e para trás, com movimentos oscilatórios em vários planos durante 2 minutos e, imediatamente, verificar a presença ou não de aglutinação macroscópica, comparando o resultado da amostra com os padrões obtidos com os controles.

5. Proceder à interpretação da reação:

Negativo: Suspensão homogênea semelhante ao padrão obtido com o controle negativo.

Positivo: Aglutinação macroscópica que varia desde a formação de grumos finos até grumos grosseiros, caracterizando uma concentração maior que 200 UI/mL. As características da aglutinação não devem ser usadas como indicadoras da concentração de AEO na amostra. Para isto deve-se diluir a amostra utilizando o método semi-quantitativo.

Significado clinico

A antiestreptolisina O é um anticorpo decorrente da interação imunológica entre o organismo e produtos extra celulares do Estreptococo. A resposta imunológica depende da idade do paciente, localização geográfica e da frequência das infecções estreptocócicas. Como as infecções estreptocócicas são comuns, a AEO está presente em baixos títulos na maioria das pessoas. Títulos elevados e crescentes, atingindo um nível máximo em 4-6 semanas após a infecção, sugerem infecção estreptocócica recente. Portanto, as determinações seriadas que documentam a elevação da AEO, são evidências mais significativas de infecção recente que o resultado de um teste isolado.

Quando um paciente tem sinais que sugerem febre reumática, é muito importante verificar a ocorrência de uma infecção recente. O teste é um importante marcador para diagnóstico diferencial entre febre reumática e artrite reumatóide quando o quadro clínico não é decisivo, visto que a AEO não se eleva na artrite reumatóide.

Em pacientes com suspeita de glomerulonefrite pós estreptocócica, a evidência de infecção recente pode ser encontrada nos títulos em elevação da AEO. Também nas infecções estreptocócicas da faringe observam-se títulos de AEO maiores que 200 UI/mL.

A maioria das crianças com infecção estreptocócica da pele não desenvolvem títulos significativos da AEO.

É importante enfatizar que a AEO é um marcador de infecção estreptocócica e não deve ser utilizada como uma prova de atividade reumática. Como a AEO é um anticorpo, sua elevação se processa no mínimo após 7 dias do inicio do processo infeccioso, não sendo um marcador de processo inflamatório com elevação tão precoce quanto a Proteína-C Reativa.

Resultado

Negativo (não houve aglutinação na amostra do soro do paciente).

TIPAGEM SANGUINEA

INTRODUÇÃO

A Tipagem Sanguínea é um teste realizado para estabelecer qual tipo sanguíneo e Fator Rh (positivo ou negativo) uma pessoa possui. É muito importante saber o tipo de sangue antes de se fazer uma transfusão sanguínea, pois pode haver incompatibilidade entre o doador e o receptor e, em casos de emergência, pode haver necessidade desta transfusão.

Pessoas dos grupos A, B e O produzem naturalmente anticorpos que causam reações graves se receberem por transfusão sangue incompatível. Se uma pessoa Rh-negativa receber sangue (for transfundida) Rh-positivo, ela começa a produzir anticorpos anti-Rh. Estes causarão problemas se essa pessoa voltar a receber outra transfusão de sangue Rh-positivo.

A tipagem do grupo Rh é importante durante a gravidez, porque pode haver incompatibilidade entre a mãe e o feto. Se a mãe for Rh-negativa e o pai for Rh-positivo, o feto pode ser Rh-positivo e a mãe pode desenvolver anticorpos que atravessam a placenta e destroem as hemácias do feto.

OBJETIVO

Determinar o grupo sanguíneo de uma pessoa e que tipos de sangue ou derivados de sangue ela pode receber.

MATERIAIS

· Tubo de ensaio;

· Pipeta;

· Ponteira;

· Grade;

PROCEDIMENTO DO EXAME

· Em um tubo de ensaio colocar 500µl de sangue total e 4,5 ml de solução salina;

· Centrifugar a 1500 RPM por 2 minutos;

· Desprezar o sobrenadante;

· Repetir o mesmo procedimento por 3 vezes;

· Obter uma suspensão à 5%

· Retirar 100 µl da e adicionar no tubo A, B e Rh

· Adicionar no tubo A 2 gotas de anti-A

· No tubo B, 2 gotas de anti-B

· E no Rh, 2 gotas de anti-Rh.

· Centrifugar por 2 minutos

· Observar se houve aglutinação ou não.

RESULTADO

Tabela 1: Grupo sanguíneo

GRUPO SANGUÍNEO E FATOR RH	PODE RECEBER SANGUE
A positivo	A positivo, A negativo, O positivo, O negativo
A negativo	A negativo, O negativo
B positivo	B positivo, B negativo, O positivo, O negativo
B negativo	B negativo, O negativo
AB positivo	AB positivo, AB negativo, A positivo, A negativo, B positivo, B negativo, O positivo, O negativo
AB negativo	AB negativo, A negativo, B negativo, O negativo
O positivo	O positivo, O negativo
O negativo	O negativo

O paciente obteve o grupo sanguíneo tipo O e o Rh negativo (-)

LAVAGEM DE HEMÁCIAS

O procedimento de lavagem de hemácias requer pelo menos três lavagens sucessivas com soro fisiológico, deixando uma taxa residual de plasma de aproximadamente 0,8%. Tem também a finalidade de remover, ao máximo possível, as proteínas plasmáticas, os leucócitos e as plaquetas.

PROCEDIMENTO

· Adicionar soro fisiológico no tubo contendo as hemácias;

· Homogeneizar lentamente até que as hemácias fiquem bem misturadas ao soro, tendo o cuidado de não provocar hemólise.

· Centrifugar a 3000 Rpm, a 10°C durante dez minutos;

· Após a centrifugação, decantar o sobrenadante para um frasco. Este primeiro sobrenadante apresentará um aspecto hemolisado.

· Repetir a operação, até que o sobrenadante apresente um aspecto límpido. Normalmente tornam-se necessárias 3 lavagens.

· Na última lavagem deixar um pouco soro fisiológico no tubo que contém as hemácias lavadas.

A lavagem do concentrado de hemácias remove quase todo o plasma.

Indicações:

· Hemoglobinúria paroxística noturna;

· Reações transfusionais do tipo alérgico ligadas à presença de anti-corpos anti-IgA;

· Insuficiência renal grave.

PREPARO DA SUSPENSÃO DE HEMÁCIAS A 5%

PROCEDIMENTO

- Em um tubo cônico colocar 1 mL de sangue total homogeneizado colhido com anticoagulante + 9mL de soro fisiológico (NaCl 0,85%).

- Centrifugar a 2.500 rpm durante 2 minutos.

- Desprezar o sobrenadante.

- Repetir este procedimento mais 2 vezes.

- A partir do sedimento de hemácias lavadas, preparar uma suspensão a 5% (50µL do sedimento de hemácias + 950µL de soro fisiológico).

INTERPRETAÇÃO

Grupo Sanguíneo	Anti-A	Anti-B
AB	+	+
A	+	-
B	-	+
O	-	-

Sinal + indica presença de aglutinação
Sinal – indica ausência de aglutinação

PROVA CRUZADA

FUNDAMENTO

Consiste na pesquisa de incompatibilidade entre receptor e doador, mediante a mistura dos dois sangues. Se ocorrer reação antígeno-anticorpo (incompatibilidade), esta poderá ser visualizada através da aglutinação ou hemólise.

PROCEDIMENTO

· Centrifugar as amostras de sangue do doador e receptor.

· Tomar 4 tubos de hemólise e numerá-los de 1 a 4.

· Nos tubos 1 e 3 colocar 2 gotas do plasma do receptor e uma gota de hemácias do doador.

· Nos tubos 2 e 4 colocar 2 gotas de plasma do doador e uma gota de hemácias do receptor.

· Colocar os tubos no banho-maria por 5 minutos.

· Centrifugar.

· Realizar a leitura.

INTERPRETAÇÃO

Não poderá ocorrer hemólise ou aglutinação em nenhum dos tubos. O teste de Coombs também deverá apresentar resultado negativo. Caso contrário, a transfusão não poderá ser realizada.

GRUPO	AGLUTINOGENIO	AGLUTININA
A	A	Anti-B
B	B	Anti-A
AB	A e B	---
O	---	Anti-A e Anti-B

TOXOPLASMOSE

INTRODUÇÃO

A toxoplasmose é uma infecção causada por um protozoário, o toxoplasma gondi. Ele pode parasitar todas as células nucleadas, as manifestações clínicas podem ser muito variáveis, tais como: coriorretinites, miocardites, pericardites, pneumonias, miosites, meningo encefalites, hepatites, ocorrendo isoladamente ou combinadas, certas vezes difusas, vistas em pacientes portadores de imunodeficiências ou recebendo terapêutica imunossupressora.

AMOSTRA

Usar soros frescos ou conservados a -20ºC (máximo de 4 a 6 semanas) de pacientes em jejum. As amostras devem estar a temperatura ambiente antes do uso e não necessitam de qualquer tratamento prévio. Não usar soro hemolisado, contaminado ou lipêmico. Evitar o congelamento e descongelamento repetidos das amostras. Os soros envelhecidos tendem a se gelificar ao contato com o 2-Mercaptoetanol.

MATERIAIS

• Tubos de ensaio

• Pipetas sorológicas

• Estante de tubos e rack

• Recipiente para descarte de material

PROCEDIMENTO

Objetivo: para triagem e eliminação dos soros não reagentes.

1. Colocar a placa sobre um pano úmido para neutralizar as forças eletrostáticas.

2. Usar 1 cavidade da placa por amostra, incluindo sempre os controles positivo e negativo, prontos para uso.

ATENÇÃO: Não diluir os soros controles. Estes são fornecidos prontos para uso.

3. Utilizar diluição do soro 1/32 com a solução diluente (2). Recomenda-se diluir em um tubo de ensaio 10μl da amostra + 310μl da solução diluente.

4. Pipetar 25μl do soro controle positivo, negativo e da diluição 1/32 de cada amostra nas respectivas cavidades da placa. Sugere-se: A1 controle positivo, A2 controle negativo eA3, A4, A5... soros a serem testados.

5. Adicionar 25μl da suspensão homogênea de hemácias (1) em cada cavidade.

6. Agitar a placa por vibração mecânica (agitador de placa) ou batendo com os dedos nas bordas da placa por 3 a 4 minutos.

7. Deixar em repouso por 1 a 2 horas em temperatura ambiente, em local livre de vibrações (IMPORTANTE).

8. Fazer leitura (ver procedimento semi quantitativo).

INTERPRETAÇÃO

Soros que dão reação negativa são informados como NÃO REAGENTES significam ausência de infecção atual ou pregressa para toxoplasmose.

Nos casos em que ocorre reação negativa, mas com suspeita clínica de toxoplasmose, deve-se repetir o teste após alguns dias, pois pode tratar-se de período pré-sorológico.

Todos os soros que apresentam reação positiva deverão ser testados quantitativamente para determinação da fase da doença.

TESTE SEMI QUALITATIVO

1. Partir de uma diluição do soro de 1/32 conforme item 3 do teste qualitativo.

2. Pipetar 25μl da solução diluente (2) a partir da segunda cavidade da placa até a diluição que se pretende estudar. Ex.: Se pretende diluir o soro até 1/512, pipetar 25μl do diluente nas cavidadesA2, A3, A4 eA5. Não pipetar naA1.

3. Transferir 25μl da diluição do soro 1/32 para a primeira (A1) e segunda (A2) cavidades. Homogeneizar bem o soro com diluente na segunda cavidade diluição 1/64) e transferir 25μl para a terceira cavidade (diluição 1/128) e assim sucessivamente, desprezando 25μl no final.

4. Pipetar 25μl da suspensão homogênea de hemácias (1) em todas as cavidades.

5. Agitar a placa por vibração mecânica (agitador de placas) ou batendo com os dedos nas bordas da placa por 3 a 4 minutos.

6. Deixar em repouso por 1 a 2 horas na temperatura ambiente, em local livre de vibrações (IMPORTANTE).

7. Fazer leitura.

Reação negativa: Quando as hemácias se depositam no fundo da cavidade

Formando um botão.

Reação positiva: Quando as hemácias se depositam no fundo da cavidade como um tapete, às vezes com bordas irregulares.

Título da amostra: Maior diluição que mostra uma reação positiva. O ponto final é quando o tapete de hemácias cobre 50% do fundo da cavidade.

Determinação de infecção recente (IgM) ou presença de anticorpos inespecíficos: O uso do 2-Mercaptoetanol possibilita a diferenciação, nos testes de hemaglutinação, de infecção recente ou presença de anticorpos inespecíficos.

PROCEDIMENTO

1. Realizar o teste do soro tratado com 2-Mercaptoetanol paralelo ao Teste

Semi Quantitativo.

2. Tratamento do soro: pipetar em um tubo de ensaio 10 l de soro inativado ou não, 310 l da solução de 2-Mercaptoetanol diluído (corresponde a uma diluição 1:32). Incubar a 37ºC por 1 hora.

INTERPRETAÇÃO:

Teste Negativo: paciente não imune ou em fase pré-sorológica. Se houver suspeita clínica, repetir após 1 ou 2 semanas.

Títulos do soro tratado e não tratado com 2-ME semelhantes (menos de 2 diluições): Provável toxoplasmose pregressa.

ATENÇÃO: este resultado não exclui infecção recente (presença de IgM) e, portanto, técnicas mais sensíveis como a imunofluorescência ou ELISA para detectar IgM devem ser usadas.

Queda de 2 ou mais títulos do soro tratado em relação ao não tratado: provável infecção recente (presença de IgM).

ATENÇÃO: se os títulos forem baixos e o tratado negativar, deve-se afastar a presença de anticorpos inespecíficos, repetindo-se o teste após 1 a 2 semanas e observando se ocorre aumento do título.

IMUNOLOGIA CLINICA

sexta-feira, 25 de março de 2016

ALUNOS 01_2016

domingo, 27 de setembro de 2015

RELATÓRIOS 02_2015